基于rDNA-ITS序列的甘肅甘南野生羊肚菌遺傳多樣性分析

王龍 周慶平 劉建明

摘要：通過對采自甘肅甘南藏區的16株野生羊肚菌菌株進行分子生物學分析，對rDNA基因內轉錄間隔區（ITS）片段進行PCR擴增并測序，測序結果在GenBank中進行BLAST比對，鑒定得知，16株供試羊肚菌共歸納為5種，分別為黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps）、羊肚菌（Morchella esculenta）、高羊肚菌（Morchella elata）、粗腿羊肚菌（Morchella crapssipes）和尖頂羊肚菌（Morchella conica）。根據采用最大簡約法（MP）和鄰接法（NJ）構建的分子進化樹得知，2種分子進化樹拓撲結構相似，并且Bootstrap驗證顯示，系統發育樹各分支都有很高的支持率，說明其系統關系有很高的可信度。結果可為該地區羊肚菌（Morchella spp.）的系統分類提供較為準確的分子性狀依據。

關鍵詞：rDNA-ITS;羊肚菌;序列分析;甘肅甘南

中圖分類號： S646.701 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）17-0081-04

羊肚菌（Morchella spp.）是羊肚菌科羊肚菌屬所有種類的總稱，是一類經濟價值很高的珍稀野生食（藥）用真菌，具有較高的營養價值和藥用價值[1]。據有關資料顯示，羊肚菌含有多種生理活性物質，尤其是蛋白質含量極為豐富，同時還含有人體必需的各類氨基酸、維生素和鐵、鋅等多種礦質元素[2-3]。在羊肚菌的分類學研究中，由于其形態特征具有很大的可塑性和人為性，給分類研究工作帶來很多困難，單純依靠傳統形態分類方法很難解決羊肚菌的系統學問題，分子生物學的飛速發展為從分子水平解決羊肚菌的系統學問題提供了新的技術方法和研究平臺[4-6]。針對我國羊肚菌主產地之一的甘肅甘南藏區，到目前為止，除20世紀80年代有學者開展過有關當地羊肚菌資源學方面的研究報道外[7-8]，至今鮮見有關該地區羊肚菌分子系統學方面的研究。鑒于上述問題，本研究試圖從傳統形態分類學以及分子系統學角度來探討甘肅甘南境內野生羊肚菌的系統發育關系。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株為2017年4—5月在甘肅甘南境內的迭部縣、舟曲縣收集到的野生羊肚菌菌株。供試菌株總共16株，結合《中國大型真菌原色圖鑒》[9]對菌株進行鑒定并分別編號為GN-M1、GN-M2、GN-M3、GN-M4、GN-M6、GN-M9、GN-M10、GN-M12、GN-M14、GN-M17、GN-M19、GN-M22、GN-M25、GN-M27、GN-M31、GN-M32（圖1）。

1.2 主要試劑

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）裂解緩沖液（pH值為8.0，美國Genview公司）;2×PCRmix（上海時代生物科技有限公司）;DL2000 DNA marker（日本Takara公司）;瓊脂糖（上海艾研生物科技有限公司）;EDTA（乙二胺四乙酸）、氯仿、異戊醇、無水乙醇、鹽酸、乙酸鈉、氯化鈉、Tris（三羥甲基氨基甲烷）均為國產分析純。擴增ITS片段（內轉錄間隔區）所用的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體為上游引物ITSl：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.3 總DNA提取

取供試菌株羊肚菌子實體的菌蓋部分，參照白永宏等的研究方法[10]，經多次改進、驗證，探索出適合本試驗的DNA提取技術。（1）稱取浸泡、沖洗、消毒后的羊肚菌子實體菌蓋約0.5 g，切碎置于無菌預冷的研缽中，加入適量液氮，研磨至粉末狀。（2）迅速將其轉入2 mL離心管中，加入1.5 mL預熱至65 ℃的CTAB（pH值為8.0）裂解緩沖液，緩慢顛倒混勻后，置于65 ℃下水浴1.5 h，每隔10 min顛倒混勻1次。（3）在 12 000 r/min 下離心15 min，將上清液移至新的離心管中。（4）加入等體積的苯酚和氯仿，緩慢搖勻，在 12 000 r/min 下離心10 min，將上清液移至新的離心管中。（5）加入等體積的氯仿和異戊醇，緩慢搖勻，在12 000 r/min下離心 10 min，將上清液移至新的離心管中。（6）加入2倍體積預冷的無水乙醇，輕輕混勻，在-20 ℃下靜置3.0 h后在12 000 r/min 下離心 10 min，棄去上清液，留DNA沉淀。（7）用75%乙醇洗滌DNA沉淀2次，棄去上清液。（8）離心、真空抽干得到DNA，每管加入適量無菌水溶解沉淀DNA，在-20 ℃下低溫保存備用。

1.4 PCR擴增

1.4.1 PCR擴增反應體系 PCR擴增反應體系為50 μL，含10×PCR buffer 5.0 μL;dNTPs 1.0 μL;模板DNA 1.0 μL;ITS1 1.0 μL;ITS4 1.0 μL;Taq聚合酶1.0 μL;雙蒸水40.0 μL。

1.4.2 PCR擴增程序 PCR擴增程序為94 ℃預變性2 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸100 s，35個循環;72 ℃延伸10 min，終止溫度為 4 ℃。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測ITS-PCR擴增產物，用凝膠成像系統拍照并記錄電泳譜帶。

1.5 ITS片段測序

PCR擴增產物經電泳檢測后，使用上海基康生物技術有限公司提供的UNIQ-10柱式DNA回收試劑盒進行回收和純化，并將樣品報送上海基康生物技術有限公司進行測序。將獲得的菌株序列結果在GenBank上進行BLAST分析，利用軟件CLUSTALX 1.81刪除缺失位點和殘缺位點，然后進行同源性比較，最后用軟件MEGA 6.06通過最大簡約法（maximum parsimony，MP）和鄰位相連法（neighbour joining，NJ）分別構建分子系統發育樹，明確供試菌株的種屬及分類地位[11-13]。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

16株野生羊肚菌ITS片段PCR擴增結果見圖2。

2.2 ITS序列測序及BLAST比對分析

本試驗中的16株羊肚菌標本所測得的ITS序列長度和GC含量見表1。登陸Genbank數據庫，將所測得的序列進行BLASTN比對分析。結果發現，GN-M1、GN-M2、GN-M6和GN-M10的核苷酸序列與登錄號為JQ691485、DQ257338、AJ698476、JX069625的黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps）ITS序列相似度達99%;GN-M3、GN-M4、GN-M9和GN-M12與登錄號：U51851、AJ543741的羊肚菌（Morchella esculenta）ITS序列相似度達99%;GN-M14、GN-M22、GN-M17和GN-M19與登錄號為GQ249378、GQ249383、EU83482的高羊肚菌（Morchella elata）ITS序列相似度達97%～98%;GN-M25和GN-M31與登錄號為EU701002的粗腿羊肚菌（Morchella crassipes）ITS序列相似度達99%;GN-M27和GN-M32與登錄號：AM269501的尖頂羊肚菌（Morchella conica）ITS序列相似性達97%～98%。

2.3 基于ITS序列系統樹的構建

為了更好地探討甘肅甘南藏區野生羊肚菌的系統發育關系，從GenBank數據庫下載了與本研究相關的羊肚菌科鐘菌屬（Verpa）的3個ITS序列（登錄號分別為GU551670、GU551672、JN043311）以及羊肚菌屬中的普通羊肚菌（Morchella vulgaris）、小海綿羊肚菌（Morchella spongiola）、半開羊肚菌（Morchella semilibera）、變紅羊肚菌（Morchella rufobrunnea）（登錄號分別為AF000971、JQ691480、AF008233、DQ355921）的ITS序列，對其進行BLASTN比對分析后，分別采用鄰接法（neighbour-joining，NJ）和最大簡約法（maximum parsimony，MP）構建分子進化樹，結果分別見圖3和圖4。

由圖3和圖4可以看出，NJ和MP這2種方法構建的系統發育樹拓撲結構相似，并且Bootstrap驗證顯示，系統發育樹各分支都有很高的支持率，說明系統關系的可信度高。結合測序結果分析，本試驗中16株羊肚菌經分子鑒定最終歸類為5種，分別為黑脈羊肚菌（GN-M1、GN-M2、GN-M6、GN-M10）、羊肚菌（GN-M3、GN-M4、GN-M9、GN-M12）、高羊肚菌（GN-M14、GN-M22、GN-M17、GN-M19）、粗腿羊肚菌（GN-M25、GN-M31）和尖頂羊肚菌（GN-M27、GN-M32），這5種羊肚菌主要歸類于黃羊肚菌類群（羊肚菌、粗腿羊肚菌）和黑羊肚菌類群（尖頂羊肚菌、黑脈羊肚菌、高羊肚菌）。

通過對系統發育樹的分析發現，登錄號為GU551670和GU551672的鐘菌屬（Verpa）的2個菌種聚為一支，但登陸號為JN043311的鐘菌屬（Verpa）的1個菌種卻和羊肚菌聚為一類;登錄號為AF000971的普通羊肚菌和登陸號為JQ691480的小海綿羊肚菌與羊肚菌（GN-M3、GN-M4、GN-M9和GN-M12）、黑脈羊肚菌（GN-M1、GN-M2、GN-M6、GN-M10）親緣關系較近，可以聚為一類;登錄號為DQ355921的變紅羊肚菌與尖頂羊肚菌（GN-M27、GN-M32）、粗腿羊肚菌（GN-M25、GN-M31）大體聚為一類;登錄號為AF008233的半開羊肚菌與其他羊肚菌遺傳距離較遠，似乎可與鐘菌屬（Verpa）的2個菌種GU551670和GU551672聚為一類，究其原因還有待進一步深入研究。

3 結論

經分子生物學研究得知，16株供試羊肚菌菌株可歸納為5種，分別為黑脈羊肚菌（GN-M1、GN-M2、GN-M6、GN-M10）、羊肚菌（GN-M3、GN-M4、GN-M9、GN-M12）、高羊肚菌（GN-M14、GN-M22、GN-M17、GN-M19）、粗腿羊肚菌（GN-M25、GN-M31）和尖頂羊肚菌（GN-M27、GN-M32），且這5種羊肚菌主要歸類于黃羊肚菌類群（羊肚菌、粗腿羊肚菌）和黑羊肚菌類群（尖頂羊肚菌、黑脈羊肚菌、高羊肚菌）。通過分子進化樹分析得知，利用最大簡約法（MP）和鄰接法（NJ）2種方法構建的系統發育樹拓撲結構相似，并且Bootstrap驗證顯示，系統發育樹各分支都有很高的支持率，說明其系統關系有很高的可信度，同時也說明本研究結果可為該地區羊肚菌的系統分類提供較為明確的分子性狀依據。本研究中的羊肚菌經分子鑒定后的結果與依據形態學分類的結果有一定差異，分析原因可能是該地區羊肚菌子實體的形態變化多樣，其菌種的形態特征和生理生化指標又受多種外界因素的影響，這對其進行形態學分類具有很大的限制性。至于當前甘肅甘南境內還分布有該屬多少種羊肚菌，還有待今后全方位地采集更多新鮮樣品進行分離鑒定。此項工作的開展不但可以豐富該地區羊肚菌多樣性分析的菌種資源庫資料，還可為當地羊肚菌的人工栽培及其今后的開發利用提供科學理論與依據。

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