胃癌中VEGFR2的表達及與患者預后的關系

張 峰,唐建榮,王振東

(駐馬店市中心醫院 消化內科,河南 駐馬店463000)

血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)是參與血管生成的一種酪氨酸激酶受體，被其配體血管內皮生長因子(VEGF)激活后可促進鄰近的血管生成，為癌細胞的生長提供營養，促進癌細胞的增殖、遷移和轉移[1]。VEGF和VEGFR2介導生成的血管有助于胃癌的侵襲，導致胃癌的高死亡率[2]。VEGFR2在乳腺癌[3]、肺癌[4]、膠質母細胞瘤[5]、胃腸道癌癥[6]、腎細胞癌[7]、卵巢癌[8]、膀胱癌[9]和骨肉瘤[10]中的高表達也得到證實。本文主要研究VEGFR2在胃癌中的表達，對患者術后生存率的影響及對胃癌細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌細胞MNK-28和胃正常上皮細胞GES-1購于中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心；RPMI1640培養基、MTT粉末、二甲基亞砜和結晶紫等購于北京鼎國有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；阿帕替尼購于上海恒瑞醫藥有限公司；細胞侵襲實驗的小室購于美國康寧公司。

1.2 樣本收集及術后隨訪收集2012年5月至2014年5月在我院進行胃癌手術104例患者的胃癌組織和胃癌旁組織，均經兩名病理醫師確診。將患者組織放入液氮中浸潤，然后放置-80℃冰箱保存待用。根據胃癌組織中VEGFR2的表達平均水平，將其分為高表達組和低表達組。所有患者在術后均進行常規的化療未進行靶向治療。本實驗研究經過患者同意，并簽署知情同意書。隨訪時間3-60個月，中位隨訪時間43個月，隨訪日期自手術日起到患者死亡或隨訪時間結束為止。

1.3 qRT-PCR按照Trizol試劑說明提取組織和細胞中的總RNA。VEGFR2上游引物序列為5′-GGACTCTCTCTGCCTACCTCAC-3′、下游引物序列為5′-GGCTCTTTCGCTTACTGTTCTG-3′，U6上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′、下游引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTA-3′。根據反轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，逆轉錄條件為42℃ 60 min，72℃10 min。cDNA采用BIO-RAD CFX96系統進行實時定量PCR檢測VEGFR2的表達，以U6作為內參。每個待測基因設4個復孔。數據通過BIO-RAD CFX96系統進行處理，按照公式RQ=2-ΔΔCT計算各組間的倍數關系。

1.4 RNA干擾實驗VEGFR2的小干擾RNA(5′-GGAAATCTCTTGCAAGCTA-3′)和陰性對照RNA(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)，由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。轉染至MNK-28細胞中設置為對照組和VEGFR2 sh-RNA組，24 h后檢測VEGFR2的mRNA水平。

1.5 細胞增殖實驗對照組和VEGFR2 sh-RNA組細胞以每孔1×104的密度接種于96孔板中，設置不同的檢測時間點，將噻唑藍溶液加入96孔板中，放置恒溫箱中靜置4 h。棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，在振蕩器上震蕩5 min，使細胞充分裂解，用酶標儀檢測細胞的光密度(OD)。

1.6 細胞侵襲實驗對照組和VEGFR2 sh-RNA組細胞用100 μl無血清培養基懸浮，每孔3×104個細胞接種于小室。配置600 μl含有20%血清的培養基加入小室下部，注意小室下部不能有氣泡產生，否則會影響細胞的遷移或侵襲能力，在恒溫箱中培養48 h。取出小室棄掉溶液，依次置于多聚甲醛和結晶紫中進行固定和染色。用棉簽輕輕擦去未發生侵襲的細胞，采用貼壁細胞計數法，計算每個視野中發生侵襲的細胞數。

2 結果

2.1 VEGFR2在胃癌組織和細胞中高表達且與患者的不良生存率有關在胃癌組織中VEGFR2的mRNA水平明顯高于胃癌旁組織(P<0.05)；在胃癌細胞MNK-28中VEGFR2的mRNA水平明顯高于胃正常上皮細胞(P<0.05)；VEGFR2 高表達組患者的生存率明顯低于VEGFR2低表達組(P<0.01)。見圖1。

圖1 VEGFR2在不同胃癌組織和細胞中的表達水平及對患者生存率的影響

2.2 VEGFR2促進胃癌細胞的增殖VEGFR2 shRNA轉染至MNK-28細胞中，VEGFR2的表達降低；經過細胞增殖實驗檢測，VEGFR2 shRNA組細胞的增殖與對照組相比有所減弱；另外，10 μmol/L的阿帕替尼處理組細胞與對照組相比，細胞的增殖能力也明顯減弱。見圖2。

圖2 VEGFR2對胃癌細胞增殖的影響

2.3 VEGFR2促進胃癌細胞的侵襲VEGFR2 sh-RNA組和阿帕替尼組細胞發生侵襲的細胞數分別為38±8、32±7，均低于對照組發生侵襲的細胞數65±7(P<0.01)。見圖3。

3 討論

VEGFR2的調節在腫瘤的研究中一直是受關注的話題，在某些腫瘤中現已確定VRGFR2及其配體的高表達，與患者預后不良相關，應用與VEGFR2相關的靶向治療，可抑制腫瘤血管生成，可改善晚期胃癌患者的預后[11]。在乳腺癌中，僅在三陰性乳腺癌中檢測到VEGFR2的高表達，并促進上皮間質轉化，激活NF-κB和β-catenin信號通路[12]。在卵巢癌中，VEGFR2通過激活Src介導干細胞的能力，上調Bmi促進干細胞樣細胞增殖[8]。在膀胱癌中VEGFR2可作為circRNA-MYLK的下游驅動基因，促進Ras/ERK信號通路的激活[9]。

在本研究中，我們通過收集胃癌患者術后的胃癌組織及胃癌旁組織，檢測到胃癌組織中VEGFR2的表達明顯增加，另外在胃癌細胞中也檢測到VEGFR2的表達增加。經過對患者的術后隨訪，并通過統計分析VEGFR2高表達組患者的生存率明顯低于VEGFR2低表達組。說明VEGFR2的高表達與胃癌患者的不良預后相關。為了進一步研究VEGFR2促進胃癌發生發展的原因，又進行以下細胞實驗。采用RNA干擾實驗，減弱MNK-28細胞中VEGFR2的表達，檢測到VEGFR2低表達組細胞的增殖能力和侵襲能力與對照組相比明顯減弱。阿帕替尼為VEGFR2的靶向藥物，是第一個被證實在晚期胃癌標準化療失敗后安全有效的小分子抗血管生成靶向藥物，同時，阿帕替尼也是目前晚期胃癌

圖3 VEGFR2對胃癌細胞侵襲的影響

靶向藥物中唯一的口服制劑。在本文中采用10 μmol/L的阿帕替尼處理MNK-28細胞24 h后，檢測到細胞的增殖能力和侵襲能力明顯減弱。由此證明，VEGFR2在胃癌中促進細胞的增殖和侵襲，通過靶向藥物阿帕替尼的處理，可明顯減弱由VEGFR2所引起的細胞增殖和侵襲。綜上所述，VEGFR2通過增加胃癌細胞的增殖和侵襲能力促進胃癌發生發展并與患者的預后不良相關。