不同地理種群麥長管蚜對殺蟲劑的抗藥性與相關解毒酶的通徑分析

武銀玉,曹亞萍,范紹強,趙 飛,邢 鯤

(1 農業有害生物綜合治理山西省重點實驗室,太原030000;2 山西省農業大學小麥研究所,臨汾041000)

蚜蟲是小麥生產上的重要害蟲,分布范圍極廣,為害嚴重[1]。 麥長管蚜(Sitobion avenae)是小麥穗蚜期麥蚜優勢種群,在我國麥區發生密度相當大[2]。 近年來,隨著全球氣候變暖,我國北方地區冬季溫暖少雨、年后氣溫回升快[3],不僅為小麥后期的穗蚜提供了適宜的生存和繁殖環境,而且使蟲害呈現出提前發生、危害期長、峰期蚜量大等特點,對小麥生產造成嚴重威脅[4]。 目前生產上多采用化學藥劑輔以精耕深翻、適時晚播等農業措施進行防治[5],但藥劑長期過量使用造成麥蚜敏感性下降,抗藥性問題日趨突出。

殺蟲劑是害蟲防治的有效途徑之一[6],對殺蟲劑產生抗藥性是昆蟲的自然適應性特征。 昆蟲通過降低表皮穿透作用(行為抗性)和靶標部分的敏感性(靶標抗性),增強自身對藥物的代謝能力(代謝抗性)這3 種途徑實現對農藥的抗性[6-7]。 其中,代謝抗性主要通過解毒酶來增強對農藥的轉化和降解,以此降低農藥對其產生的毒性。 昆蟲的解毒酶是一類異質酶系,主要包括羧酸酯酶(CarE)[8]、谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)[9]和多功能氧化酶(MFOs)[10]。

各地種群對不同殺蟲劑產生的抗性程度不一,而不同種群代謝解毒酶的差異又必然影響各種群對藥劑的敏感性。 本研究以山西省南部黃淮北片冬麥區的3 個不同地理種群麥長管蚜為研究對象,探討麥長管蚜的抗性機理,為麥蚜的區域化治理和可持續控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2019 年5 月上旬(小麥抽穗灌漿期)在山西南部小麥主產區選擇3 個典型的麥蚜發生較重的地塊:韓村(36°8′56.04″N,111°35′7.8″E)、張禮(35°59′24.36″N,111°25′15.24″E)、洪堡(36°12′5.76″N,111°32′2.04″E)。各地塊分別采集1 000 頭以上麥長管蚜,分別命名為韓村種群、張禮種群、洪堡種群,于室內條件下[溫度:(22±1)℃;相對濕度50%—70%;光照17L:7D]用麥苗喂養10 d,選取個體大小一致的健康無翅成蚜進行生物測定[11]。 以室內不接觸任何藥劑連續飼養兩年以上的麥蚜種群作為敏感種群(對照)。

1.2 主要試劑

殺蟲劑(原藥):95.3%吡蟲啉、98%毒死蜱、95%高效氯氰菊酯、98%啶蟲脒,購于利爾化學股份有限公司;95%抗蚜威購于鄭州凱瑞農化工產品有限公司;羧酸酯酶CarE 活性測定試劑盒、谷胱甘肽-S-轉移酶GSTs 活性測定試劑盒和多功能氧化酶MFO 活性測定試劑盒,均由蘇州科銘生物技術有限公司生產;丙酮,天津市大茂化學試劑廠;磷酸二氫鈉,天津登峰化學試劑廠;磷酸氫二鈉,天津科密歐化學試劑有限公司;無水乙醇,天津市光復科技發展有限公司。

1.3 測定方法

1.3.1 毒力測定

采用玻璃管藥膜法[12]略加改進,進行毒力測定。 先將殺蟲劑用丙酮配置成2 000 mg∕L 的母液,儲存于4 ℃冰箱,使用時用丙酮將母液稀釋成所需濃度,從稀釋好的藥液中吸取180 μL 加入到直徑2 cm、高5.2 cm 的玻璃管(內表面積36 cm2)中,將玻璃管放于操作臺上勻速滾動,使藥液均勻分布于玻璃管內壁,待丙酮揮發。 對照僅用丙酮處理。 每個玻璃管內放入成蚜20 頭,用保鮮膜封口并刺以小孔。 每種藥劑按照田間推薦用量等設6 個濃度梯度,重復3 次。 在室內正常飼養,3 h[13]后檢查死亡率。 用毛筆輕觸蟲體,僅有一只足動或者完全不動者視為死亡,對照死亡率小于10%為有效測定。

1.3.2 酶活性測定

挑取100 mg 無翅成蚜,加1 mL 磷酸緩沖液,勻漿,4 ℃離心,吸取上清液作為待測母液,-20 ℃保存。不同種類的酶選用濃度不同的磷酸緩沖液和離心條件:羧酸酯酶(CarE)為pH 7.0、0.04 mol∕L 磷酸緩沖液,10 000g離心30 min;谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)為pH 7.5、0.1 mol∕L 磷酸緩沖液,8 000g離心10 min;多功能氧化酶(MFO)為pH 7.5、0.1 mol∕L 磷酸緩沖液,12 000g離心20 min。

酶活性測定參照各試劑盒說明書進行。 生物重復3 次。

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析。 運用機率值分析法[14]分別計算LC50值和抗性倍數。 采用Duncan 氏新復極差法進行酶活性差異顯著性檢驗,并對抗性水平和酶活性進行相關分析和通徑分析。

抗性倍數(Resistance ratio,RR)為田間種群LC50值與敏感種群LC50值的比值。 小麥蚜蟲對殺蟲劑的抗性水平[12]可分為6 個等級:RR ＜3 為敏感,3≤RR ＜5 為敏感性下降或耐藥性,5≤RR ＜10 為低水平抗性,10≤RR ＜40 為中等水平抗性,40≤RR ＜160 為高水平抗性,RR≥160 為極高水平抗性。

2 結果與分析

2.1 不同地理種群麥長管蚜對殺蟲劑的抗藥性

由表1 可知,吡蟲啉對麥長管蚜韓村、張禮、洪堡種群LC50分別為0.554 μg∕cm2、0.777 μg∕cm2、0.223 μg∕cm2,張禮麥區抗性水平最高,是敏感種群的4.92 倍,其次為韓村種群(3.51),兩個種群抗性水平都處于敏感性下降階段,洪堡種群尚處于敏感水平(1.41);抗蚜威對3 個麥長管蚜種群LC50分別為0.572 μg∕cm2、0.415 μg∕cm2、0.430 μg∕cm2。 韓村種群敏感性較差,達中抗水平(12.71),張禮、洪堡種群抗性水平相對較低,但也達到低抗水平(9.22,9.57);毒死蜱對3 個麥長管蚜種群的LC50分別為0.543 μg∕cm2、0.883 μg∕cm2、0.571 μg∕cm2,以張禮麥區對毒死蜱的抗性最高,達到11.62,處于中抗水平,其他兩地種群均達到低抗水平;各地麥長管蚜對啶蟲咪(0.74—1.28)和高效氯氰菊酯(0.65—1.06)表現為無抗性或僅處于敏感水平。

表1 不同地理種群麥長管蚜對不同藥劑的抗藥性水平Table 1 Resistance levels of Sitobion avenae to different insecticides in different geographical populations

2.2 不同地理種群麥長管蚜的解毒酶活性

由表2 可知,除洪堡種群多功能氧化酶活性有所降低外,其他種群的解毒酶活性相比室內敏感種群均有不同程度地上升。 韓村、張禮種群的羧酸酯酶活性分別為敏感種群的1.59 倍、1.84 倍,差異極顯著,洪堡種群與敏感種群之間無顯著差異;3 個種群谷胱甘肽-S-轉移酶活性分別是敏感種群的1.78 倍、1.64 倍、1.38 倍,與敏感種群均達到極顯著差異;韓村最高,與張禮種群間差異顯著,與洪堡種群存在極顯著差異;韓村、張禮種群的多功能氧化酶活性顯著高于敏感種群,分別為敏感種群的1.54 倍和1.42 倍,洪堡種群多功能氧化酶活性與敏感種群無顯著差異。

表2 不同地理種群麥長管蚜解毒酶活性Table 2 Comparison of detoxifying enzymes activities of Sitobion avenae in different geographical populations

2.3 麥長管蚜對殺蟲劑抗藥性水平與解毒酶活性的相關及通徑分析

由表3 可知,麥長管蚜種群對吡蟲啉的抗性水平與三種解毒酶活性存在顯著正相關,與羧酸酯酶、多功能氧化酶活性相關系數分別為0.932、0.801,達到極顯著水平,與谷胱甘肽-S-轉移酶相關系數為0.708,達到顯著水平;麥長管蚜對抗蚜威的抗性水平與谷胱甘肽-S-轉移酶活性存在顯著相關,相關系數為0.669;對毒死蜱的抗性水平與羧酸酯酶活性存在顯著正相關,相關系數為0.697,與其他兩種酶相關性不顯著。

表3 麥長管蚜對各藥劑的抗藥性水平與三種解毒酶活性的相關性Table 3 Relevance between insecticide sensitivity and three detoxification enzymes activity of Sitobion avenae

為進一步明確各解毒酶活性對殺蟲劑抗藥性的作用,在相關分析的基礎上進行了通徑分析,結果表明:麥長管蚜GarE、MFO 對吡蟲啉抗藥性呈現正向效應(0.781,0.505),說明麥長管蚜通過提高體內這兩種酶活性來達到分解吡蟲啉的目的,GST 直接通徑系數為負( -0.346),但由于GST 和MFO 兩種酶對吡蟲啉的正向效應(0.572,0.482)使其最終仍顯示正相關(0.708);GST 對抗蚜威抗藥性呈現正向效應(0.877),且達顯著水平(0.669),說明GST 活性在麥長管蚜對抗蚜威抗性中起主要作用;MFO 對抗蚜威抗性水平呈正向效應(0.661),其通過GarE 呈現負效應( -0.918),相關性不顯著(0.580);GarE 對抗蚜威抗性呈現負效應( -1.145),但因為間接作用表現為正向(0.643,0.530),最終與抗蚜威抗藥性水平顯示正相關(0.028);對毒死蜱抗藥性呈現正向效應的只有GarE(1.346),其間接效應雖然表現為負效應( -0.614,-0.036),卻不足以抵消GarE 活性對毒死蜱抗性的正向效應,相關性顯示顯著正相關(0.697),表示麥長管蚜主要通過提高體內GarE 酶活性來降低毒死蜱的濃度,其他兩種酶直接通徑系數為負,且對毒死蜱抗藥性作用不顯著。

表4 麥長管蚜對各藥劑的抗性水平與三種酶活性關系的通徑分析Table 4 Path analysis of the relationship between insecticide sensitivity and three enzyme activities of Sitobion avenae

3 討論

化學藥劑雖然能夠在一定程度上遏制麥蚜種群數量的擴大[15],但是長時間、高頻率、高劑量地應用,會使種群產生不同程度的抗性。 本研究結果表明,相較于室內敏感種群,山西省南部麥區麥長管蚜三個地理種群對各殺蟲劑的抗藥性存在一定差異,但整體趨于一致,其中對抗蚜威、毒死蜱已經產生低至中等水平抗性,對吡蟲啉尚處于敏感或敏感性下降階段,對啶蟲咪、高效氯氰菊酯無抗性或僅處于敏感水平,這與當地經銷商對某種藥劑的推廣力度及農戶的用藥頻率等有關。 建議少用或不用抗蚜威和毒死蜱,混合使用吡蟲啉,或選擇低毒低殘留的植物源類殺蟲劑以避免抗藥性繼續發展,增加防治難度。

昆蟲抗藥性的產生是對殺蟲劑進行選擇的必然結果[16]。 昆蟲在殺蟲劑的選擇壓力下,通過增強體內解毒酶的活力和提高酶蛋白與殺蟲劑分子的親和性等方式,加速對殺蟲劑的解毒代謝作用而使昆蟲表現出抗藥性[7]。 通常認為,高水平抗性由代謝抗性和靶標抗性共同作用產生,而較低水平抗性往往由代謝導致[17]。 本研究中種群抗藥性水平較低,故測定了羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、多功能氧化酶三種代謝解毒酶活性,結果顯示除洪堡種群多功能氧化酶活性下降外,其他種群的解毒酶活性相比室內敏感種群均有不同程度地上升。 相關分析和通徑分析結果表明羧酸酯酶、多功能氧化酶與谷胱甘肽-S-轉移酶三種解毒酶共同作用以降解吡蟲啉對麥長管蚜的毒性,羧酸酯酶、多功能氧化酶起正向效應,谷胱甘肽-S-轉移酶通過其他兩種酶起間接作用。 邱高輝等[18]證實麥長管蚜對吡蟲啉的抗性機制與羧酸酯酶和多功能氧化酶相關,本研究顯示谷胱甘肽-S-轉移酶也起一定作用。 谷胱甘肽-S-轉移酶通過催化谷胱甘肽與有毒親電子類物質發生結合反應,將其代謝為低毒物質排出體外達到解毒目的,還能作為載體結合蛋白俘獲有毒物質,行使解毒功能[19]。 羧酸酯酶通過水解含酯鍵的殺蟲劑,降低體內有毒物質的濃度,在對有機磷、擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性中起重要作用[20],本研究中,羧酸酯酶活性對毒死蜱抗性顯示正向效應,表示麥長管蚜主要通過提高體內羧酸酯酶活力來降低毒死蜱的濃度。 總之,昆蟲對藥劑的代謝抗藥機理相當復雜,在多種酶協同作用下,昆蟲體內維持一種活性優化的平衡狀態,以達到代謝殺蟲劑的目的。

本研究雖然在一定程度上解釋了麥長管蚜對殺蟲劑的抗藥性與解毒酶之間的關系,但還停留在生理生化水平,如要確定解毒代謝酶活性的提高是由于基因擴增或者表達的改變還是基因結構突變[21-22]等,還要進一步做分子水平的研究。