Cu2+改性SBA-16固定化漆酶的研究

夏 峰

(南京醫科大學康達學院，江蘇 連云港 222000)

酶作為一種生物大分子催化劑，具有高效、專一、溫和、綠色等特點，在各個領域被廣泛應用，并且被逐步提高到戰略應用的高度[1-2]。雖然酶具有如此優越的性能，但游離酶的使用經常受到環境的限制，穩定性不好且不能重復使用，而將酶固定化后則可以將酶有效地從反應體系中分離出來，從而提高酶的穩定性并可多次使用[3-5]。漆酶是一種單電子氧化還原酶，含有四個銅離子且銅離子是其活性中心的重要組成部分，穩定性較好，底物專一性寬泛，在有機藥物、生物傳感器、廢水處理等鄰域被廣泛應用[6-9]。作為催化劑的載體，介孔分子篩具有較大的比表面積和孔容，是一種非常有前途的固定化酶載體[10]，與SBA-15和MCM-41相比，SBA-16是一類孔道規整，具有超大籠狀的 Im3m型體心立方結構材料[11]，其較厚的孔壁、高的比表面積和熱穩定性，尤其是其三維孔道的連通性更有利于物料的傳輸及反應物及產物的擴散，使得SBA-16在催化、吸附、分離和生物大分子的固定等方面有著良好的應用前景。本文以SBA-16為載體，用銅離子對其進行改性，然后通過吸附漆酶制備了一種固定化漆酶，結果顯示，Cu/SBA-16固定化漆酶的活性與Cu2+負載量呈現出一定的正相關性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

微量天平，搖床，pH計，Biomate 3S紫外分光光度計，離心機。

1.2 試劑

漆酶，SBA-16分子篩，乙酸銅，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O， 2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(簡稱ABTS)。

2 實驗方法

2.1 Cu/SBA-16制備

稱取五份0.1 g的SBA-16，分別懸浮于10 ml Cu2+濃度為10、20、30、40、50 mmol/L的乙酸銅水溶液中，室溫下浸漬24 h，然后過濾，去離子水洗滌，干燥得到藍色樣品，記為Cu/SBA-16。

2.2 漆酶的固定化

將0.1 g的SBA-16或Cu/SBA-16加到10 mL系列不同濃度漆酶的0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，以160 r/min的轉速搖晃20 h，然后離心，用磷酸鹽緩沖液洗滌固體多次，直到離心液中檢測不到酶活，所得固定化漆酶記為M/SBA-16和M/Cu/SBA-16。

2.3 游離酶及固定化酶活性的檢測

游離酶活性的檢測：取一定濃度的游離漆酶溶液與1.0 mmol/L的ABTS溶液進行等體積反應，以適當pH值的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液為反應體系，紫外分光光度計測定體系在4 min內420 nm處的吸光度變化情況，吸光度變化越大，酶的活性越高。

固定化酶活性的檢測：稱0.1 g上述固定化漆酶，依次加入4 mL適當pH值的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和2 mL 1.0 mmol/L的ABTS溶液，反應3 min后，馬上置于冰水浴中停止反應，然后檢測上清液在420 nm處的吸光度變化情況。

3 結果與討論

3.1 最適pH值

酶的活性與反應體系的pH值有很大關系，不同pH值體系對游離漆酶活性的影響如圖1所示[12]。本實驗中漆酶可以催化ABTS生成一種藍色物質，酶的活性越高，生成的藍色物質顏色越深，其吸光度也越大，即酶的活性與反應體系的吸光度變化成正比。從圖中可以看到，隨著反應的進行，不同pH值體系的吸光度值均不斷增大，但其增大的速度卻不相同，其中，pH值為3的反應體系的吸光度增大地最快，說明此時漆酶的活性是最高的，即游離漆酶的最適pH值為3左右。

圖1 pH值對漆酶活性的影響

3.2 載酶量對固定化漆酶活性的影響

在最適pH值下配制不同濃度的漆酶溶液，然后在SBA-16上進行固定化，得到不同載酶量的M/SBA-16，然后用分光光度計檢測固定化漆酶的活性，結果如圖2所示，M/SBA-16的活性隨著載酶量的提高先快速升高然后趨于穩定，當載酶量為96 mg/g時，M/SBA-16的活性達到較高水平，繼續增大載酶量，M/SBA-16的活性變化不大，這可能是由于太多的漆酶分子堆積于SBA-16分子篩孔道內，影響了反應物質的擴散與傳輸。與SBA-15的負載量(48 mg/g)相比[12]，SBA-16具有三維立體孔道結構，因此其具有更高的酶負載量。

圖2 載酶量對固定化漆酶活性的影響

3.3 Cu2+對固定化漆酶活性的影響

圖3 Cu2+對固定化漆酶活性的影響

Cu2+作為漆酶活性中心的重要組成部分，對漆酶的活性有重要影響。在最適pH值與最佳載酶量下，本文制備了不同Cu2+含量的M/Cu/SBA-16并考察其對漆酶活性的影響。結果如圖3所示，負載Cu2+后，M/Cu/SBA-16固定化漆酶的活性與Cu2+濃度呈現一定的正相關性，隨著Cu2+濃度的升高，固定化漆酶的活性隨之升高，但Cu2+濃度上升到一定程度后，固定化漆酶的活性不再升高，這可能是由于高濃度的Cu2+并沒有有效提高Cu2+在SBA-16上的負載量，因此相應的固定化酶的活性也不再升高。

進一步研究表明，純SBA-16載體以及當Cu2+單獨負載于SBA-16上時并不會對底物ABTS有催化作用，結果如表1所示。由此可見，所制備的固定化酶M/Cu/SBA-16中，漆酶是發揮催化作用的主要因素，而Cu2+對固定化酶具有促催化作用。

表1 不同催化劑的相對活性

4 結論

SBA-16具有超大籠狀的立方結構，具有較高的比表面積和熱穩定性，其三維孔道的連通性更有利于物料的傳輸及反應物及產物的擴散，是一種性能優異的固定化酶載體。通過本文的研究，漆酶通過物理吸附法可以固定于SBA-16的孔道內，其最適pH值為3左右，最佳載酶量為96 mg/g左右。負載Cu2+后，Cu2+對固定化酶M/Cu/SBA-16具有促催化作用，且固定化漆酶的活性隨著Cu2+濃度的升高而升高，但Cu2+濃度上升到一定程度后，固定化漆酶的活性不再升高。