CDCA3在下咽鱗癌中的表達及臨床意義

吳俊福 代立媛 崔萌 杜偉 劉善廷 婁衛華

下咽鱗癌的惡性程度較高，5年總生存率僅為15%～45%，近幾十年無較大的改善［1］，在治療上具有挑戰性。下咽鱗癌侵襲性強，早期易發生黏膜下擴散，頸部轉移風險高。據報道約60%～80%患者發生同側頸部淋巴結轉移，40%患者有對側頸部淋巴結隱匿性轉移，而且疾病的早期即可出現頸部淋巴結和遠處轉移，是影響預后的重要因素［2］。因此，尋找與下咽鱗癌生長、轉移及預后相關的分子標記物對研究其發生發展、生物學行為及治療具有十分重要的臨床意義。

細胞的快速生長和分裂是包括下咽鱗癌在內的所有惡性腫瘤的共同特征。細胞周期調節蛋白的不適當表達可以促進腫瘤的發生［3］。大量研究報道了癌變與細胞周期相關基因的關系。特別是近期的研究表明，對G1/S 階段靶點的Skp1-cullin-F-box（SCF）控制的放松也可能有助于腫瘤的發生。作為SCF 組分之一的細胞分裂周期相關蛋白3（cell division cycle associated protein 3，CDCA3）與腫瘤的關系近年來受到關注。研究發現，CDCA3在多種腫瘤中表達上調，與腫瘤預后存在密切的關系，有可能成為治療的新靶標。但是CDCA3在下咽鱗癌中的表達情況及與預后的關系國內外鮮見相關報道。

本研究從Oncomine腫瘤芯片數據庫中的腫瘤基因組圖譜（TCGA）數據集中分析得到CDCA3 在頭頸部鱗癌及癌旁正常組織中存在DNA 表達差異，結合患者的臨床病理特征及隨訪資料，分析CDCA3 與下咽鱗癌患者臨床病理特征及預后之間的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

下咽鱗癌組織和癌旁正常黏膜組織均取自2018年9月至2019年9月鄭州大學附屬腫瘤醫院手術切除的15 例下咽鱗癌患者（表1）。切除的組織標本在手術離體后快速冷凍，液氮保存。其它腫瘤組織進行常規病理診斷。并擴大樣本量收集臨床資料完整的80 例下咽鱗癌患者的石蠟切片進行免疫組織化學檢測。標本選自2010年7月到2015年7月本院手術的下咽鱗癌患者。所有入選病例均符合條件：1）術前未進行放、化療的初治患者；2）術后病理診斷為下咽鱗癌；3）接受包括手術切除在內的標準治療。所有病例臨床資料均完整可靠，均簽署書面知情同意書，獲得本院倫理委員會批準。所有患者通過門診或住院就診、電話、微信等方式隨訪，確診時間為起點，均進行5年隨訪，期間若有腫瘤復發、轉移或死亡則終止隨訪。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及抗體 RNA提取試劑盒購自上海普飛公司，M-MLV 試劑盒購自美國Promega 公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自上海Beyotime 公司，dNTPs購自美國Promega公司，辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗購自美國Cell Signaling Technology 公司，GAPDH 抗體購自美國Santa-Cruz 公司，CDCA3 抗體購自美國Sigma 公司，預染蛋白Marker 購自美國Thermo Fisher Scientific公司

1.2.2 實驗方法 1）qRT-PCR檢測CDCA3在下咽鱗癌和癌旁組織中的mRNA 表達：CDCA3 引物長度為261 bp，上游引物為5′-ATTGCACGGACACCTATGA-3′，下游引物為5′-TGTGGGCTGTCTTGCTTC-3′。GAPDH的引物長度為121 bp，上游引物為5′-TGACTTCAACAG CGACACCCA-3′，下游引物為5′-CACCCTGTTGCTGT AGCCAAA-3′。取15例下咽鱗癌組織和癌旁正常黏膜組織，Trizol提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，進行qPCR擴增，使用2-△△cT法計算并分析CDCA3的mRNA相對表達量。

2）應用Western blot 法檢測CDCA3 在下咽鱗癌和癌旁組織中的蛋白表達：隨機選取5對下咽鱗癌組織和癌旁正常黏膜組織檢測CDCA3 蛋白表達水平。組織樣品在冰上剪碎后用RIPA 裂解液提取蛋白質，用BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天公司）定量。將提取的蛋白樣品用SDS-PAGE 分離并轉移至PVDF膜上，然后用特定的一抗和適當的二抗進行免疫印跡。使用ECL-PLUS試劑盒檢測蛋白條帶。

3）采用免疫組織化學法檢測CDCA3在下咽鱗癌中的表達：將80 例下咽鱗癌石蠟塊連續切片，切片厚度約4 μm，置入60℃烘箱內烤片。在檸檬酸緩沖液中進行抗原修復之前，梯度酒精中水化。切片與抗CDCA3（1:150 稀釋度）一抗在4℃下孵育過夜。PBS洗滌3次后，將辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗在37℃孵育1 h。本院病理科兩位病理醫師各自在光學顯微鏡下判讀所有的IHC 染色切片。根據細胞染色的強弱直觀評分：0 分陰性（無染色），1 分弱陽性（淡黃色），2分陽性（棕黃色），3分強陽性（棕色）。陽性細胞染色率評分：0分（＜5%），1分（5%～30%），2分（31%～50%），3分（5l%～75%），4分（＞75%）。CDCA3染色評分由CDCA3 染色強度與百分比總分之和確定。總分≥4分為CDCA3陽性表達，總分＜4分為陰性表達。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。數據為計數資料，組間比較用χ2檢驗。生存率估計采用Kaplan-Meier法，生存時間間比較用對數秩檢驗。單因素Cox 回歸模型分析影響預后的因素，多因素Cox 回歸模型進一步分析影響預后的因素。所有統計學分析均為雙側，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CDCA3 DNA拷貝數在頭頸鱗癌組織中的表達

在Oncomine 腫瘤芯片數據庫的TCGA 數據集中進行差異分析，結果顯示CDCA3 在頭頸鱗癌組織和正常組織之間差異顯著，相比全血及頭頸部正常組織，CDCA3的DNA拷貝數在頭頸鱗癌組織中顯著上調（P=3.81E-13，圖1）。

2.2 CDCA3 mRNA及蛋白在下咽鱗癌組織中的表達

通過在Oncomine腫瘤芯片數據庫中進行差異分析，本研究采用實時熒光定量反轉錄PCR 檢測了15對新鮮下咽鱗癌組織及癌旁正常黏膜中CDCA3的表達情況。結果顯示與配對癌旁正常下咽黏膜相比，下咽鱗癌組織中CDCA3 的mRNA 相對表達水平升高，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖2）。同時隨機選擇5 對下咽鱗癌及癌旁正常組織應用Western blot法檢測CDCA3的蛋白表達情況，結果顯示CDCA3在下咽鱗癌組織中的相對蛋白表量較癌旁正常組織顯著升高（圖3）。

表1 15例下咽鱗癌患者的臨床特征

圖1 CDCA3 基因的DNA 拷貝數在頭頸鱗癌組織、全血及正常頭頸部組織中的表達

2.3 CDCA3在下咽鱗癌中的表達與臨床病例特征的相關性分析

采用免疫組織化學法檢測80例患者的臨床病理特征（表2）。CDCA3在下咽鱗癌中的表達，結果顯示CDCA3 蛋白主要在胞質中表達（圖4）。CDCA3 在81.2%（65/80）的下咽鱗癌組織中陽性表達，在18.8%（15/80）陰性表達。分析CDCA3 與下咽鱗癌臨床病理特征的關系（表3），結果表明T1～T2 組CDCA3 的相對表達水平低于T3～T4 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。無淋巴結轉移組CDCA3的相對表達水平低于淋巴結轉移組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。Ⅰ+Ⅱ期組中CDCA3 的相對表達水平低于Ⅲ+Ⅳ期組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。CDCA3 的相對表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤的原發部位、吸煙飲酒史、病理分級等無關（P＞0.05）。

圖2 CDCA3 mRNA在下咽鱗癌組織及癌旁正常組織的表達

圖3 CDCA3蛋白在下咽鱗癌組織及癌旁組織的表達

2.4 CDCA3表達與下咽鱗癌患者預后的關系

采用Kaplan-Meier 生存曲線分析結果提示，CDCA3表達上調與生存時間顯著相關。CDCA3陽性表達組患者的總生存期顯著低于CDCA3陰性表達組（P=0.001，圖5）。CDCA3陽性表達病例組5年生存率為16.4%，而CDCA3陰性表達病例組為35.6%。單因素Cox 比例風險回歸分析提示，CDCA3 表達、腫瘤大小、臨床分期和淋巴結轉移是影響預后的因素。多因素Cox比例風險回歸分析表明，CDCA3表達是影響下咽鱗癌患者生存狀態的獨立預后因素（P＜0.05），而腫瘤大小（T分期）、區域性淋巴結轉移情況及TNM分期均不能作為患者的獨立預后危險因素，其協同發揮作用影響下咽鱗癌患者的預后（表4）。

表2 80例下咽鱗癌患者的臨床病理特征

圖4 CDCA3在下咽鱗癌中的表達（IHC×100）

表3 下咽鱗癌組織中CDCA3 的表達與患者臨床病理特征的關系 例

圖5 CDCA3表達水平與下咽鱗癌患者預后之間的關系

表4 下咽鱗癌患者預后相關因素的單因素及多因素Cox回歸分析

3 討論

CDCA3 也稱為Tome-1（有絲分裂進入的觸發器）。CDCA3含有1個F-box基序，可與Skp1和cullin結合，通過刺激某些蛋白質如細胞周期調節蛋白、轉錄因子和信號轉導分子的降解來調節人體內的許多生理和病理過程。最近的研究表明，CDCA3 在各種癌癥的發生發展中起著關鍵作用［4-13］，并且與腫瘤預后存在密切的關系，可能是一種致癌F-box 蛋白，有可能成為治療腫瘤的新靶標。

Itzel 等［11］在對163 種腫瘤的微陣列數據集的生物信息學研究中，發現了1 個嚴密調控的基因網絡，包括具有預后重要性的CDCA3。該研究通過RT-qPCR 法驗證了生物信息學分析結果，并證明與正常組織中的表達水平相比，CDCA3 在乳腺癌、腎癌、肺癌和卵巢癌中的轉錄水平上調。目前，鮮見CDCA3 在下咽鱗癌中的報道，其表達情況與下咽鱗癌患者預后的關系以及可能的作用機制不清。本研究首先應用qRT-PCR 及Western blot 技術檢測發現，下咽鱗癌組織中CDCA3的表達與癌旁組織相比在轉錄及翻譯水平均明顯上調，同時采用免疫組織化學法檢測結果顯示，在80 例下咽鱗癌組織標本中，65 例標本CDCA3 陽性表達，與CDCA3 在胃癌、結直腸癌、非小細胞肺癌、口腔鱗癌等多種惡性腫瘤中表達情況一致［4，6-10］。Qian等［8］對結直腸癌組織中CDCA3表達與臨床病理因素進行分析后發現，CDCA3 的高表達與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結侵犯顯著相關。Zhang等［4］研究胃癌組織中CDCA3的表達情況發現，CDCA3高表達與腫瘤大小、分化程度、原發腫瘤、淋巴結轉移和TNM 分期有關。本研究結合80 例下咽鱗癌中CDCA3 表達情況，分析CDCA3 陽性表達與臨床病理參數之間的關系，發現CDCA3陽性表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期顯著相關。上述研究結果均提示CDCA3 陽性表達與下咽鱗癌的發生發展有關，CDCA3可能在下咽鱗癌中起到癌基因的作用。

下咽癌由于其發病位置較深且隱蔽，早期癥狀不典型，出現癥狀后就診的下咽癌患者中，超過70%患者為Ⅲ期和Ⅳ期［14］，腫瘤往往已經向周圍組織器官侵犯，如喉、舌根、食管等部位，同時伴有頸部淋巴結轉移，預后較差。Hall等［15］開展的一項包括595例下咽癌的臨床研究發現，接受治療的患者中20%有殘留，47%患者在3年后腫瘤無復發，50%患者在治療后的第1年內復發，其中50%出現遠處轉移。下咽鱗癌的惡性程度較高，治療上具有挑戰性，術后常造成呼吸和吞咽等功能受損。影響下咽鱗癌的預后因素較多，如腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM 分期等因素，為了研究CDCA3 是否與下咽鱗癌預后相關，本研究應用單因素Cox比例風險回歸分析發現，CDCA3的陽性表達、腫瘤大小、臨床分期和淋巴結轉移是影響預后的因素，經過多因素Cox 比例風險回歸分析，表明CDCA3表達是影響下咽鱗癌患者生存的獨立預后因素，而原發腫瘤大小（T 分期）、區域性淋巴結轉移情況及TNM 分期均不能作為預后的獨立危險因素，其協同作用影響下咽鱗癌患者的預后。進一步證明了CDCA3參與了下咽鱗癌發生發展過程。然而，CDCA3在下咽鱗癌中的促癌作用的具體機制及分子通路尚未明確，將是后續研究工作的主要方向。

綜上所述，CDCA3 在下咽鱗癌組織中表達顯著增加，其陽性表達與患者的原發腫瘤大小、TNM分期以及頸部淋巴結轉移情況相關。而且下咽鱗癌CDCA3的陽性表達是影響患者預后的獨立危險因素，本研究結果表明CDCA3在下咽鱗癌中可能起到癌基因的作用，可能成為下咽鱗癌分子治療的新靶點。