中成藥抑制巨噬細胞炎性細胞因子釋放的體外研究*

郭 虹，蒲位凌，周 昆，韓立峰，郝 佳，常艷旭，高秀梅，王 濤

（天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617）

2019年底爆發的新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠肺炎，COVID-19）疫情，已在全世界百余國家和地區迅速傳播，不但嚴重擠壓醫療資源，更引起世界范圍的恐慌。新型冠狀病毒感染以發熱、干咳、乏力為主要表現，重癥患者出現急性呼吸窘迫綜合征及多器官衰竭等癥狀。《柳葉刀》上發表的1項研究指出，在危重患者中可見“細胞因子風暴”發生[1]。新型冠狀病毒感染后，短時間內大量產生多種細胞因子，導致人體免疫系統功能的紊亂，造成嚴重機體損傷，這種極端的免疫攻擊即稱之為“細胞因子風暴”。新型冠狀病毒感染重癥患者血漿白介素（IL）-6、IL-10等炎性細胞因子明顯升高[2]。有研究分析了123例COVID-19病例的細胞免疫和細胞因子情況，觀察到重癥組IL-6升高的比例明顯高于輕癥組[3]。這些數據均提示重癥COVID-19患者存在炎性反應水平高的特點。

目前臨床主要應用糖皮質激素平息細胞因子風暴，但糖皮質激素是一把“雙刃劍”，除了引起骨質疏松的不良反應，其免疫抑制作用還會阻礙機體對病毒的抵抗和清除，限制了它在COVID-19的應用。國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第六版）》中強調“較大劑量激素會延緩對冠狀病毒的清除”。因此，尋找能有效干預和緩解細胞因子風暴的治療藥物，是目前防治COVID-19的迫切之需。

COVID-19屬于中醫“疫病”范疇，在數千年中華文明史上，中醫藥學對于瘟疫診治積累了豐富的臨床經驗。對待新發病毒疫情，如何結合傳統中醫理論防治疫病，發揮中醫藥防疫抗病能力成為中醫藥人的重要課題。目前中成藥品種在藥效物質、工藝品質等方面都有系統深入的研究，質量穩定，工藝可靠[4]。從已有中藥中發現有活性藥物用于疫情防治方面具有臨床轉化快速、使用安全性強等突出優勢。本研究收集了60余種市場在售中成藥，從中藥抑制細胞因子風暴角度入手，采用脂多糖（LPS）誘導RAW264.7細胞建立體外炎癥模型，考察藥物對一氧化氮（NO）生成和細胞因子釋放的抑制作用，為尋找能降低病毒感染所致細胞因子風暴水平的中成藥提供研究基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料 二氧化碳（CO2）培養箱，美國Thermo公司；IX53倒置相差顯微鏡，日本Olypums公司；Spark多功能酶標儀，瑞士Tecan司；RAW264.7小鼠巨噬細胞株購自ATCC（SC-6003）；LPS，美國Sigma公司；細胞活力檢測試劑盒、NO檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒，美國 R＆D 公司；小鼠多因子炎性因子檢測試劑盒，美國MesoScaleDiscovery公司；二甲基亞砜（DMSO），北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清、0.25%胰酶、雙抗，均為美國Gibco公司；乙醇為分析純，天津康科德科技有限公司。

1.2 中成藥提取 收集的上市中成藥均經粉碎（噴霧劑使用原料）后以10倍70%乙醇溶液（W/V）進行30 min超聲提取，以4 000 g離心10 min，離心半徑18 cm，取上清液于40℃減壓濃縮干燥。干燥粉末以DMSO配制為50 mg/mL濃度備用。

1.3 細胞培養 RAW264.7細胞培養于含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養液中。待細胞處于對數生長期，加入胰蛋白酶消化，形成單細胞懸液轉移至離心管中，1000 r/min離心5min，離心半徑14.5cm，棄上清，加入培養液細胞計數后，接種于新的培養瓶內，放置于5% CO2、37℃培養箱中培養。

1.4 細胞活力檢測 收集對數生長期的RAW264.7細胞，按1×105/mL密度接種于96孔板。48 h后分別加入不同中成藥提取物。加藥處理24 h后，取出培養板，吸去上清液，每孔加入100 μL稀釋的CCK-8溶液，37℃孵育30min，酶標儀于450nm處檢測吸光度（A值）。

1.5 Griess法檢測NO 將RAW264.7細胞以1×105/mL密度接種于96孔板，48 h后分組處理細胞。空白組不做任何處理；模型組加入終濃度1 μg/mL LPS誘導炎癥；藥物處理組分別用不同中成藥提取物和LPS共同孵育，24 h后收集細胞上清液，按照試劑盒說明書分別加入Griess ReagentⅠ和Ⅱ，酶標儀于540 nm處測定吸光度，用標準品溶液的吸光度與濃度做標準曲線，計算各樣品處理細胞上清液中NO的濃度。

1.6 細胞因子檢測 分組及處理方法同1.5，收集細胞上清液待測。一部分上清液稀釋后按ELISA試劑盒操作說明，檢測TNF-α含量。一部分上清液按照小鼠多因子炎性因子檢測試劑盒說明書操作，用稀釋液進行1∶1稀釋后檢測炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10等的含量。以各中成藥提取物的高劑量抑制率做雷達圖，抑制率（%）＝（模型組-給藥組）/（模型組-空白組）×100%。

1.7 統計方法 使用SPSS 20.0軟件包進行分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05時認為具有統計學差異。

2 結果

2.1 中成藥對RAW264.7細胞活力的影響 首先采用CCK-8法檢測不同中成藥提取物在50 μg/mL時對正常RAW264.7細胞活力的影響。結果顯示，牛黃清心丸（局方）（天津中新藥業集團股份有限公司達仁堂制藥廠）提取物在50 μg/mL時對正常RAW264.7細胞活力無影響，而藿香正氣軟膠囊（天津中新藥業集團股份有限公司達仁堂制藥廠）、牛黃解毒丸（天津中新藥業集團股份有限公司達仁堂制藥廠）、穿心蓮內酯滴丸（天士力醫藥集團股份有限公司）3個中成藥提取物在 50 μg/mL時對RAW264.7細胞活力有明顯抑制作用。

因此進一步降低藥物濃度，考察藿香正氣軟膠囊、牛黃解毒丸、穿心蓮內酯滴丸3個中成藥提取物在25 μg/mL對RAW264.7細胞活力的影響。結果顯示，藿香正氣軟膠囊、牛黃解毒丸、穿心蓮內酯滴丸3個中成藥提取物在25 μg/mL劑量下對正常培養RAW264.7細胞活力均無影響，見圖1。

2.2 中成藥對NO生成的抑制作用 選用LPS誘導RAW264.7細胞復制體外炎癥損傷模型，考察藥物對NO生成量的抑制作用。結果顯示，與空白組比較，模型組NO生成顯著增加，說明LPS誘導炎癥模型成功；與模型組比較，牛黃清心丸（局方）、藿香正氣軟膠囊、牛黃解毒丸、穿心蓮內酯滴丸均能顯著抑制LPS誘導RAW264.7細胞NO生成量，提示以上藥物可能具有抗炎作用，見圖2。

2.3 中成藥對細胞因子分泌的調節作用 細胞因子失衡可引發炎癥級聯反應、是導致全身性免疫失調的重要因素，本研究利用LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型，在各中成藥有效抑制NO的劑量下，考察了藥物對多種細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10）分泌的調節作用。實驗結果表明，LPS引起 TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10 分泌升高，牛黃清心丸（局方）、藿香正氣軟膠囊、牛黃解毒丸、穿心蓮內酯滴丸的高劑量組均能顯著抑制LPS誘導的細胞因子生成，見表1。為將多因子的藥效結果可視化，采用雷達圖表示不同藥物的綜合效果。雷達圖中 TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10 為 5 個維度，最外維表示抑制率100%，越靠近中心點表示抑制率越低。綜合藥效以穿心蓮內酯滴丸最明顯，其他藥物對各細胞因子有不同程度的抑制作用，見圖3。

3 討論

病毒性肺炎是一種由病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，由上呼吸道向下蔓延引發肺部炎癥，導致肺換氣功能障礙。研究顯示，呼吸道病毒感染常導致機體的細胞因子水平異常，重癥患者血漿中IL-1β、IL-6、MCP-1 和 TNF-α 等細胞因子顯著增高，形成“細胞因子風暴”[5]。“細胞因子風暴”反應主要發生在肺部的血管壁內皮細胞，感染可能會導致大量免疫細胞向肺部集中，同時使肺部血管通透性增大，可導致肺炎、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、呼吸衰竭、休克等癥狀，嚴重者可能導致死亡[6]。

自嚴重急性呼吸綜合征（SARS）疫情爆發以來，“細胞因子風暴”就引發高度關注。SARS病毒，甲型H1N1流感病毒，H7N9高致病禽流感病毒等多種病毒均可導致“細胞因子風暴”[7-9]。肺炎患者預后差通常與下呼吸道和其他組織中的促炎細胞因子水平極高有關[10]。專家發現，上述病毒感染患者均會出現肺細胞脫屑和透明膜形成等病理特征，提示發生了ARDS[11]。而導致ARDS的發病原因正是與細胞因子風暴有關[12]。因此目前臨床治療中，尤其對于危重癥患者如何抑制炎癥反應及細胞因子風暴是大家關注的焦點。

表1 中成藥對細胞因子的調節作用（±s）Tab.1 Regulatory effect of Chinese patent medicine on cytokines（±s）

表1 中成藥對細胞因子的調節作用（±s）Tab.1 Regulatory effect of Chinese patent medicine on cytokines（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；“0.22”是檢測下限，統計計算時以 0.22 計。

組別 劑量（μg/mL） TNF-α（pg/mL） IL-1β（pg/mL） IL-2（pg/mL） IL-6（pg/mL） IL-10（pg/mL）空白組 — 56.58± 7.75 0.35±0.07 0.22 0.68±0.75 579.79± 9.98模型組 — 7 590.40±3 337.15 6.01±1.27* 2.07±0.29* 470.26±39.85* 1 482.76±165.99*牛黃清心丸（局方） 50.0 2 856.00± 22.51### 0.45±0.02### 0.64±0.10## 139.67±24.13### 890.59± 44.15###25.0 5 261.68± 927.20 4.45±3.07 0.77±0.14## 645.33±24.10# 1 647.52±113.90##藿香正氣軟膠囊 25.0 4 240.91± 606.85# 1.17±0.68### 0.22### 176.23±79.94### 1 046.95± 48.57###12.5 4 119.96±1 490.18# 0.90±0.10### 0.22### 278.41±92.81# 1 088.35± 53.77###牛黃解毒丸 25.0 537.92± 81.66### 0.91±0.60### 0.22### 67.16± 9.16### 347.47± 22.65###12.5 1 749.76± 489.10### 1.79±0.27### 0.22### 184.79±22.82### 921.37± 45.68###穿心蓮內酯滴丸 25.0 55.12± 2.90### 0.28±0.02### 0.22### 4.71±1.78### 93.54±17.63###12.5 101.26± 14.31### 0.36±0.04### 0.22### 10.77± 0.07### 249.73± 14.39###

“細胞因子風暴”實際是人體免疫系統針對外界病毒和感染的過度反應，對自身也會造成傷害。因此，調節自身的免疫平衡狀態具有重要的意義。本研究采用LPS誘導RAW264.7巨噬細胞建立體外炎癥模型，從已上市中成藥出發，尋找能有效抑制“細胞因子風暴”的中成藥制劑，為臨床治療病毒性肺炎提供參考。研究結果表明，牛黃清心丸（局方）、藿香正氣軟膠囊、牛黃解毒丸、穿心蓮內酯滴丸等中成藥對LPS誘導RAW264.7細胞NO生成有顯著抑制作用，對多種細胞因子分泌有調節作用，雷達圖顯示在相同劑量下綜合藥效以穿心蓮內酯滴丸最明顯，結果提示這些上市中成藥有應用于防治病毒性肺炎的前景。值得注意的是，IL-10常被認為是抗炎因子，但在本研究中，LPS刺激后模型組IL-10分泌量較對照組升高，這可能是由于巨噬細胞在受到外源因子刺激，反饋性增加IL-10分泌，這也與肺炎IL-10報道相一致[13]。藥物干預后可使炎癥水平降低，從而恢復近正常水平。現代藥理學研究表明牛黃清心丸局方、藿香正氣軟膠囊、牛黃解毒丸中牛黃、黃芩、冰片、甘草等確有抑制細胞因子分泌的作用[14-17]，且牛黃、黃芩、甘草有抗病毒報道[18-20]，與本研究結果相一致。本研究初步證實了牛黃清心丸局方、藿香正氣軟膠囊、牛黃解毒丸、穿心蓮內酯滴丸等臨床常用中成藥潛在的防治“細胞因子風暴”的作用，可為進一步臨床應用和相關基礎研究提供一定線索。