HPLC法同時測定酸棗安神顆粒中木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷的含量研究*

河北中醫學院 河北省中藥配方顆粒技術創新中心 河北省中藥材品質評價與標準化工程研究中心

李葆林 支雅婧 楊夢婷 王 夢 王鑫國 牛麗穎 (石家莊 050091)

提要 目的：建立高效液相色譜法(HPLC)同時對酸棗安神顆粒中木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷4種化學成分進行含量測定。方法：應用HPLC進行梯度洗脫，采用Eclipse XDB- C18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸水為流動相，檢測波長270 nm，柱溫30℃。結果：木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷分別在0.054～0.807、0.047～0.699、0.019～0.292、0.062～0.930 μg范圍內與峰面積呈線性關系(γ2≥0.999 8)，加樣回收率介于98.25%～99.01%(n=6，RSD≤2%)，精密度、穩定性、重復性均良好。結論：本方法操作簡單可行，結果穩定可靠，可用于酸棗安神顆粒的質量控制，為開展質量評價提供參考。

酸棗安神顆粒是以酸棗仁為君藥，輔以茯苓、桑椹、黃精、枸杞子、佛手等藥，用以改善睡眠狀態，提高睡眠質量。君藥酸棗仁ZiziphiSpinosaeSemen為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，主產于河北、陜西、遼寧、河南等地，具有養肝、寧心、安神、斂汗之功效。[1-3]目前，有關酸棗安神顆粒的多成分含量測定未見報道，本研究采用高效液相色譜(HPLC)方法，對酸棗安神顆粒中木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷4種化學成分進行含量測定，為進一步開展質量評價及質量控制提供數據參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司；電子分析天平：TB-215D電子天平(十萬分之一)，BSA224S-CW電子天平(萬分之一)，德國賽多利斯； KQ-250型超聲波清洗器(功率250 W，頻率40 kHz)，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 酸棗安神顆粒(自制)；木蘭花堿對照品(純度99.02%，批號為MUST-17071711)購自于成都曼斯特生物技術有限公司；斯皮諾素對照品(純度95.4%，批號為111869-201203)、蘆丁對照品(純度91.7%，批號為100080-201811)橙皮苷對照品(純度96.2%，批號為110721-201818)均購自于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，水為超純水，實驗中其他試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備：分別取木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷對照品適量，精密稱定，以甲醇配制成質量分數為0.177、0.224、0.216、0.204 mg/mL的對照品儲備液。精密量取各儲備液適量，置5 mL容量瓶，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液，其中木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷的質量濃度分別為53.808、46.592、19.440、62.016 μg/mL。

2.1.2 供試品溶液：取酸棗安神顆粒適量，至50 mL具塞錐形瓶，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取15 min，冷卻至室溫，用甲醇補足缺失重量，過濾，即得。

2.2 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB- C18(4.6×250 mm，5 μm)，美國安捷倫公司流動相：甲醇(A)～0.1%磷酸水(B)；流速：1 mL/min；梯度洗脫程序：0～10 min，10%→15%A；10～25 min，15%A；25～35 min，15%→21%A；35～50 min，21%A；50.01～60 min，10%A；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃，進樣量10 μL，在此色譜條件下，各檢測成分均達到基線分離，理論塔板數均大于3 000。其HPLC色譜圖見圖1。

注：A 對照品；B 供試品。1 木蘭花堿；2 斯皮諾素；3 蘆丁；4 橙皮苷圖1 酸棗安神顆粒混合對照品與供試品溶液的HPLC圖

2.3 線性考察 分別精密吸取對照品溶液1、2、4、6、10、15 μL，以峰面積為縱坐標，以進樣量為橫坐標，按“2.2”項下條件測定各成分線性關系，繪制標準曲線。結果顯示：木蘭花堿在0.054～0.807 μg范圍、斯皮諾素在0.047～0.699 μg范圍、蘆丁在0.019～0.292 μg范圍、橙皮苷在0.062～0.930 μg范圍內均線性良好(γ2≥0.999 8)，回歸方程分別為Y=2 732 208.5x+21 865.1、Y=2 425 471.7x+5081.0、Y=1 569 008.9x+5 464 575.0、Y=1 086 437.6x+3 490.5。

2.4 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“2.2”項下條件連續測定6次，記錄峰面積。結果顯示，木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷的峰面積的RSD分別為0.59%、0.60%、0.61%、0.60%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性考察 按“2.1.2”項下要求配制供試品溶液，于0、1、2、4、6、8、12、24 h，分別精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.2”項下條件測定，記錄峰面積。結果顯示，木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷的峰面積的RSD分別為0.83%、0.89%、0.93%、0.96%，表明該供試品溶液在24 h內穩定。

2.6 重復性考察 取同一批酸棗安神顆粒約2.0 g，精密稱定，按“2.1.2”項下要求配制供試品溶液，平行6份。精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.2”項下條件測定，記錄峰面積。結果顯示，木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷的峰面積的RSD分別為0.85%、1.55%、1.69%、1.54%，表明該樣品重復性良好。

2.7 準確度考察 取同一批次酸棗安神顆粒約1.0 g，精密稱定，同時精密加入一定量木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷對照品，按“2.1.2”項下要求配制供試品溶液，平行6份。精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.2”項下條件測定，記錄峰面積。結果顯示，木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷的峰面積的加樣回收率分別為98.48%、98.59%、98.25%、99.01%，RSD均小于2%。

2.8 3批樣品含量測定 按上述方法，以3批酸棗安神顆粒配制供試品溶液并進行測定，記錄峰面積，計算供試品中木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷含量，結果詳見表1。

表1 3批樣品中的木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷含量結果 (mg/g)

3 討論

3.1 含量測定成分的選擇 酸棗仁具有補肝寧心、斂汗生津的功效，參照《中國藥典》(2015年版)規定及相關研究報道，可選用酸棗仁皂苷類，如酸棗仁皂苷A、黃酮類，如斯皮諾素或生物堿類，如木蘭花堿等作為含量測定的指標。[4-8]茯苓、桑椹、黃精、枸杞子及佛手，兼具生津潤燥、滋陰養脾、燥濕化痰之功效，其化學成分種類多樣。已有研究表明，黃酮類、生物堿類及苯丙素類成分，如蘆丁、橙皮苷、柚皮苷、槲皮素、木蘭花堿、綠原酸、新綠原酸等成分均可作為特征成分予以考察。[9-12]考慮到復方制劑的含量限度及檢測方法等因素，本研究選用木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷4種成分作為測定指標。

3.2 流動相的選擇 以待測成分色譜峰的分離度、峰型、出峰時間為指標，比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水流動相，發現甲醇-0.1%磷酸水可較好的分離各色譜峰，同時峰型美觀，基線平穩，故本實驗最終選定甲醇-0.1%磷酸水為流動相。

3.3 檢測波長的選擇 結合文獻報道及實驗DAD數據，木蘭花堿最大吸收波長為221、268 nm，斯皮諾素最大吸收波長為270、337 nm，蘆丁最大吸收波長為254、353 nm，橙皮苷最大吸收波長為283 nm。當檢測波長為270 nm時，各成分均呈現較好紫外吸收，故本實驗最終選定檢測波長為270 nm。

本文建立了HPLC法同時測定酸棗安神顆粒中木蘭花堿、斯皮諾素、蘆丁、橙皮苷4種化學成分含量，操作簡單可行，結果穩定可靠，可為進一步開展酸棗安神顆粒的質量評價及質量控制提供數據參考。