巴戟天不同極性萃取相的抗氧化及降血糖活性

曾鐵鑫，姚志仁，李豫，朱開梅，蘭圓圓，顧生玖

(桂林醫學院 藥學院，廣西 桂林，541100)

巴戟天為龍膽目茜草科植物巴戟天(MorindaofficinalisHow)的干燥根莖[1], 是四大南藥之一, 有補腎助陽，祛風除濕的功效, 主治陽痿、少腹冷痛、小便不禁、子宮虛冷、風寒濕痹、腰膝酸痛等[2]。而且巴戟天作為南藥特色藥食同源植物，具有較高的食用和藥用價值，被廣泛運用于各種保健食品中[3]。

抗氧化劑是能捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體損害的一類物質[4]，可以增強機體的抗氧化能力, 是預防和治療糖尿病及其并發癥的常用物質[5]。隨著生活中誘發自由基產生的輻射增多以及人類對健康越來越重視，抗氧化劑已成為食品以及醫學領域研究的熱點[6]，而目前常用的抗氧化劑多為西藥, 有較多毒副作用，且不能有效地控制并發癥[7]。中草藥作為植物天然產物抗氧化劑廣泛分布于自然界中，且在長期食用中沒有表現出低毒性的跡象[8]，其具有多途徑、多靶點、多向性且毒副作用小的藥理特點，近來越來越受到人們關注[9-11]。

目前，雖然關于巴戟天抗氧化活性研究已有報道，但多為寡糖成分的研究，而對于天然抗氧化劑主要評價成分多酚類、黃酮類等較少見報道[12]。本實驗通過測定巴戟天提取物不同極性萃取相總黃酮、總多酚含量，以及不同極性萃取相磷鉬酸體外抗氧化活性和對DPPH自由基、羥自由基的清除能力和抑制α-葡萄糖苷酶的能力[13]，以期尋找總黃酮、總多酚含量最高的萃取相以及抗氧化活性和降血糖能力最強的萃取相，為巴戟天資源在天然氧化劑和降血糖食品領域的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

巴戟天藥材，由中國科學院廣西植物研究所提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基，梯希愛(上海)有限公司；抗壞血酸(Vc)，天津福晨化工試劑公司；α-葡萄糖苷酶(5×106U/mL)、4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷(P-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside ，PNPG),Sigma公司；阿卡波糖,百靈威科技有限公司; 福林-酚(folin-ciocalteu),生工生物工程股份有限公司；沒食子酸,成都市科龍化工試劑廠；槲皮素,天津一方科技有限公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

高速中藥粉碎機，義海納電器有限公司；樂祺電子天平，海瑤新電子科技有限公司；全波長Epoch酶標儀，海閃譜生物科技有限公司；EYELA旋轉蒸發儀，巴玖實業有限公司。

1.3 樣品制備

取巴戟天的根莖自然風干粉碎后過40目篩，稱取粗粉1 000 g按料液比1∶10(g∶mL)加入體積分數95%乙醇，置于室溫浸泡1周后減壓抽濾，將抽濾液在旋轉蒸發儀中真空濃縮，60 ℃真空干燥得巴戟天乙醇提取物。稱取60 g乙醇提取物,用100 mL 60 ℃超純水稀釋，采用有機溶劑萃取法[14-15]對巴戟天乙醇提取物進行萃取，加入等體積石油醚反復萃取樣品 至石油醚層無色，采用同樣方法得到乙酸乙酯層、正丁醇層、氯仿層，以及萃取完剩下的水相部分。提取結束后立即進行總多酚、總黃酮含量測定以及抗氧化能力測定、自由基清除能力和抑制α-葡萄糖苷酶能力測定。

1.4 實驗方法

1.4.1 各萃取組分總多酚、總黃酮含量測定

(1)總多酚含量測定：參考文獻[16]方法并做適當修改。繪制沒食子酸標準曲線，分別取1 mg/mL氯仿相、石油醚相、醇提物相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相溶液在760 nm波長處測定其吸光度，平行實驗3次，代入標準曲線計算出各極性萃取相總多酚含量。

(2)總黃酮含量測定：參考文獻[17]方法并做適當修改。繪制槲皮素標準曲線，分別取1 mg/mL氯仿相、石油醚相、醇提物相、乙酸乙酯相、正丁醇相及水相溶液在510 nm波長處測定其吸光度，平行實驗3次，代入標準曲線計算出各極性萃取相總黃酮含量。

1.4.2 鉬藍比色法抗氧化能力的測定

采用鉬藍比色法[18-19]。稱取2 g磷鉬酸用40 mL 95%乙醇溶解,加入1 mL 體積分數5% H2SO4溶液配制成磷鉬酸溶液。將巴戟天提取物各極性萃取相分別稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的樣品溶液,在96孔板內加入200 μL磷鉬酸溶液，樣品組加入50 μL不同濃度樣品，空白對照組以50 μL 1 mg/mL的 Vc溶液替代樣品溶液，樣品對照組以50 μL 95%乙醇替代樣品溶液，輕搖混勻。95 ℃ 孵育1 h，在705 nm處測定吸光度。樣品抗氧化能力按公式(1)計算:

(1)

式中：A1,樣品溶液+磷鉬酸溶液吸光度；A2,樣品溶液+95%乙醇吸光度；A0，Vc 溶液+磷鉬酸溶液吸光度。

1.4.3 DPPH自由基清除能力的測定

參考文獻[20]的方法并適當修改。取7.88 mg DPPH用40 mL無水乙醇溶解配制成500 μmol/L DPPH-乙醇溶液。將巴戟天提取物各極性萃取相分別稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的樣品溶液, 并配制相同濃度的Vc溶液作為陽性對照。在96孔板內加入100 μL樣品溶液后再加入100 μL濃度為500 μmol/L DPPH-乙醇溶液，混勻，室溫避光反應30 min，在517 nm波長處測吸光度。根據公式(2)計算樣品對DPPH自由基的清除率:

(2)

式中：A1,樣品溶液+DPPH-乙醇溶液吸光度；A2,樣品溶液+無水乙醇吸光度；A0,超純水+DPPH-乙醇溶液吸光度。

1.4.4 羥自由基清除能力的測定

參考文獻[21-22]的方法并做適當修改。將巴戟天提取物各極性萃取相分別稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的樣品溶液, 并配制相同濃度的Vc溶液作為陽性對照。取1 mL樣品溶液, 分別加入1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液, 再加入6 mmol/L H2O2溶液0.1 mL，37℃反應30 min, 8 000 r/min離心10 min，510 nm處測定吸光度。根據公式(3)計算樣品對·OH的清除率:

(3)

式中：A1,樣品提取液+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+H2O2溶液吸光度；A2,樣品提取液+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+超純水吸光度;A0,超純水+FeSO4溶液+水楊酸-乙醇溶液+H2O2溶液吸光度。

1.4.5 巴戟天不同極性萃取相提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參考文獻[23-25] 方法并做適當修改。將巴戟天提取物各極性萃取相分別稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的樣品溶液,取150 μL不同質量濃度巴戟天各極性萃取相提取物加入96孔板內，再分別加入10 μL pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液和10 μL 1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，充分混勻后放置于37 ℃ 孵育10 min，再加入50 μL 10 mmol/L的PNPG溶液，孵育30 min后，加入50 μL 1 mol/L 的NaOH溶液終止反應。分別設置空白組、對照組、樣品組。按照表1加樣進行實驗，在410 nm波長處測定吸光度。

表1 抑制α-葡萄糖苷酶活性的實驗加樣表

單位：μL

根據公式(4)計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率:

(4)

式中：A1,樣品組吸光度；A2,空白組吸光度；A0,對照組吸光度。

1.5 統計學處理方法

實驗結果采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計算結果以平均數±標準差表示。使用GraphPad Prism 8.0進行數據處理并得出各極性萃取相相應的抗氧化能力及α-葡萄糖苷酶抑制率。

2 結果與分析

2.1 巴戟天各極性萃取相總多酚、總黃酮的含量

以沒食子酸標準溶液質量濃度為X軸, 對應吸光度為Y軸, 得到其標準曲線為y=7.881 7x-0.006 5，R2=0.993 7，質量濃度在0～0.02 mg/mL標準曲線呈良好線性關系。以槲皮素標準溶液質量濃度為X軸, 溶液吸光度為Y軸, 得到標準曲線為y=3.732 1x+0.001 5，R2=0.994 8，質量濃度在0～0.01 mg/mL標準曲線呈良好線性關系。由沒食子酸標準曲線計算得出巴戟天各極性萃取相總多酚含量，其中氯仿相多酚含量最高為(514.97±2.9)mg/g，各極性萃取相中總多酚含量依次為氯仿相>醇提物相>石油醚相>正丁醇相>水層相>乙酸乙酯相。由槲皮素標準曲線計算得出巴戟天各極性萃取相總黃酮含量，氯仿相黃酮含量最高為(46.3±1.21)mg/g，各極性萃取相中總黃酮含量依次為氯仿相>石油醚相>醇提物相>正丁醇相>乙酸乙酯相>水層相。

表2 巴戟天醇提物各極性萃取相中的總多酚和總黃酮含量 單位：mg/g

2.2 抗氧化能力測定

2.2.1 鉬藍比色法測定抗氧化能力

以Vc為對照對巴戟天提取物各萃取相進行抗氧化活性檢測，由圖1可知,各極性萃取相均有一定的抗氧化活性，在質量濃度為1 mg/mL時,氯仿相抗氧化能力最強為73.9%，高于同濃度巴戟天其他極性萃取相。巴戟天各極性萃取相抗氧化能力大小為氯仿相>乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相>水層相>醇提物相。

圖1 巴戟天各極性萃取相抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of polar phases of M.officinalis How with different polarity

2.2.2 對·OH的清除能力

如圖2所示,在實驗濃度范圍內巴戟天各極性萃取相均有一定的清除羥自由基活性,當濃度為1 mg/mL時,氯仿相清除·OH的活性最強,對·OH清除率為59.6%。巴戟天各極性萃取相對·OH清除率大小依次為氯仿相>石油醚相>正丁醇相>乙酸乙酯相>水層相>醇提物相。氯仿相各濃度對·OH的清除率均高于同濃度下其他各極性萃取相。可以證明巴戟天清除·OH活性成分主要集中在氯仿相。

圖2 巴戟天各極性萃取相對·OH清除率Fig.2 Relative hydroxyl radical scavenging rate of M.officinalis How with different polarity

2.2.3 對DPPH自由基的清除能力

如圖3所示,隨著濃度升高巴戟天各極性萃取相對DPPH自由基顯示出不同程度的清除活性，且氯仿相最高，當質量濃度為1 mg/mL時，氯仿相對DPPH自由基清除率為68.0%。巴戟天氯仿相清除率遠高于同濃度下其他相對DPPH自由基清除率。由此證明，巴戟天清除DPPH自由基活性成分主要集中在氯仿相。

圖3 巴戟天不同極性萃取相對DPPH自由基清除率Fig.3 Relative DPPH radical scavenging rate of M.officinalis How with different polarity

2.3 對α-葡萄糖苷酶抑制作用

由圖4可知,巴戟天不同極性萃取相均對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,且在一定濃度范圍內呈線性變化，氯仿相抑制效果最為明顯且強于陽性對照阿卡波糖。巴戟天各相對α-葡萄糖苷酶的抑制力強弱為氯仿相>阿卡波糖>石油醚相>醇提物相>乙酸乙酯相>正丁醇相>水層相。而氯仿相在濃度1 mg/mL時抑制率為97.9%，其各濃度抑制率都高于其他相，可以證明巴戟天中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分主要集中在氯仿相。

圖4 巴戟天不同極性萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.4 Relative α-glucosidase inhibition rates of M.officinalis How with different polarity

3 結 論

本實驗測定了巴戟天各極性萃取相的總多酚、總黃酮含量，以及測定了各極性萃取相體外抗氧化、降血糖能力。結果表明,巴戟天總多酚含量最高的為氯仿相(514.97±2.9)mg/g，總黃酮含量最高的也為氯仿相(46.3±1.21)mg/g。巴戟天各極性萃取相均有一定的體外抗氧化能力及抑制α-葡萄糖苷酶能力，并在一定濃度范圍內與樣品濃度呈線性相關。在質量濃度1 mg/mL時氯仿相磷鉬酸抗氧化能力達到73.9%，對DPPH自由基清除率為68.0%，對·OH清除率為59.6%，均高于其他相；雖弱于公認的天然抗氧化劑Vc,但也有很強的抗氧化能力。對α-葡萄糖苷酶抑制力最強的也是氯仿相，且氯仿相抑制力強于同濃度陽性對照阿卡波糖，抑制活性極好。可以得出巴戟天體外抗氧化、降血糖主要活性成分集中在氯仿相。結果表明，巴戟天提取物氯仿相總多酚、總黃酮含量均高于其他相，且體外抗氧化活性及抑制α-葡萄糖苷酶活性也高于其他相，是巴戟天提取物的主要活性部位。在抑制α-葡萄糖苷酶活性實驗中，氯仿相的活性強于陽性對照阿卡波糖，在1 mg/mL時達到97.9%。在巴戟天各極性萃取相中總多酚含量遠遠大于總黃酮含量，可以初步推測其主要活性成分為多酚類物質。本文為巴戟天在天然氧化劑和降血糖食品方面的開發利用提供參考依據。