植物乳桿菌PMO的安全性分析

王春幸，OH YOUNG JOO，甘奕，KIM TAE SUK，李洪軍，IK HYUN YEO，賀稚非*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(韓國圃美多有限責(zé)任公司，首爾，120-749)

益生菌作為對人體有益的活性微生物，對健康的調(diào)節(jié)作用獲得全球共識，驅(qū)動著益生菌行業(yè)的快速發(fā)展。其中植物乳桿菌具有良好的生理特性和益生功能，成為研究的熱點[1]。大量的研究證實，植物乳桿菌具有抗氧化[2]、調(diào)節(jié)血脂[3]、降膽固醇[4]、抑制致病菌[5]等益生功效。最新研究表明植物乳桿菌可以改變小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激和腦參數(shù)水平，從而改善學(xué)習(xí)和記憶障礙[6]。因此植物乳桿菌可用于預(yù)防或治療某些過敏性疾病[7]，作為神經(jīng)和心理疾病的潛在療法[8]，應(yīng)用發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

益生菌產(chǎn)品主要是通過調(diào)節(jié)機體代謝，增強免疫功能，在全球范圍內(nèi)發(fā)展迅速，因此必須重視益生菌的安全性問題[9]。益生菌普遍被認(rèn)為是安全的，但某些益生菌能使免疫系統(tǒng)不健全或者胃腸道功能障礙引起某些不良反應(yīng)[10]。益生菌能在胃腸道內(nèi)存活和增殖，并具有較強的內(nèi)轉(zhuǎn)移能力[11]，因此開發(fā)出新的益生菌菌株在使用前必須要進行安全性評價。本研究以從韓國泡菜中分離篩選得到的新型植物乳桿菌PMO(LactobacillusplantarumPMO)為評價對象，對所選菌株的抗生素敏感性、細菌易位、臟器指數(shù)和生化指標(biāo)等進行分析，旨在為開發(fā)新型功能性益生菌產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實驗菌株

L.plantarumPMO，韓國圃美多有限責(zé)任公司。接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，待用。

1.1.2 實驗動物

昆明小鼠：清潔級，6周齡，(20±2)g，雌雄各20只，購于藤鑫生物技術(shù)有限公司。基礎(chǔ)飼料購于重慶市中藥研究所實驗動物中心。小鼠在適應(yīng)期(7 d)內(nèi)可以自由飲水、采食。實驗前16 h禁食，但可自由飲水。飼養(yǎng)溫度為(20±2)℃，相對濕度60%。

1.1.3 主要試劑

MRS培養(yǎng)基、沙門氏菌-志賀氏菌(Salmonella-Shigella，SS)培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑有限公司；蛋白定量試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamate oxaloacetate transaminase，GOT)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamate pyruvic transaminase，GPT)試劑盒、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)試劑盒、血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)試劑，南京建成生物技術(shù)公司。

1.1.4 實驗設(shè)備

高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；XHF-D高速勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；SS-325型高壓滅菌鍋，日本Tony公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；SYNERGY HIMG酶標(biāo)儀，美國Bio Tek。

1.2 實驗方法

1.2.1 OD值與活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將培養(yǎng)24 h的L.plantarumPMO稀釋搖勻，于波長600 nm處測定其OD值，以MRS液體培養(yǎng)基作空白對照進行調(diào)零。分別選取OD值為0.10、0.20、0.30、0.45、0.60、0.70的稀釋液測定活菌數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示)。

圖1 L. plantarum PMO OD值與活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of L. plantarum OD value and viable count

結(jié)果顯示,600 nm處的吸光度值在0.10～0.70范圍內(nèi)，與活菌數(shù)具有良好的線性關(guān)系：y=1.568 3x+7.814，R2=0.989 4。

1.2.2 抗生素敏感性

L.plantarumPMO的抗生素敏感試驗以藥敏紙片瓊脂擴散法進行測定[12]。取100 μL活化24 h的菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基；培養(yǎng)基將菌液完全吸收后，將氟哌酸、頭孢拉定、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素藥敏紙片置于涂布菌液的培養(yǎng)基上；37 ℃培養(yǎng)24 h，測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑(mm)?？股孛舾行越Y(jié)果根據(jù)《CLSI抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)》判定。

1.2.3 急性毒性

根據(jù)GB 15193.3—2014中寇氏法[13]評價L.plantarumPMO對小鼠的經(jīng)口急性毒性。小鼠隨機分為4組(每組10只、雌(♂)雄(♀)各半)?；罨蟮腖.plantarumPMO以接種量1%(體積分?jǐn)?shù))接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h后4 ℃，5 000 r/min離心10 min，以無菌生理鹽水洗滌2次；以最大菌體濃度的十倍濃縮濃度作為高劑量組(5×1011CFU/mL，HL)、十倍稀釋濃度為中劑量組(5×109CFU/mL，ML)、千倍稀釋濃度為低劑量組(5×107CFU/mL，LL)；灌胃體積為20 mL/[kg(bw)·d]，連續(xù)灌胃21 d，對照組(ND)小鼠以同等體積的生理鹽水替代。

1.2.4 一般體征觀察

每日記錄小鼠的采食量與體質(zhì)量變化，并觀察攝食、飲水、活動狀況及死亡情況。

1.2.5 細菌易位

對小鼠進行灌胃24 h后，麻醉小鼠，無菌心臟穿刺獲得小鼠血液樣本。隨后解剖小鼠，以無菌棉簽擦拭臟器表面，涂布于MRS和SS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h；無菌摘取腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、肝臟，分別取1 g加無菌生理鹽水均質(zhì)；取0.1 mL血液、臟器勻漿上清液，分別涂布于MRS和SS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)基中有菌落生長即為陽性，表示細菌易位，并按公式(1)計算細菌易位發(fā)生率:

(1)

1.2.6 臟器指數(shù)

小鼠在末次灌胃24 h后稱量體質(zhì)量，脫臼處死，摘取心臟、肝臟、脾臟和腎臟。用生理鹽水沖洗臟器，濾紙吸干表面水分后稱重，按公式(2)計算臟器指數(shù):

(2)

1.2.7 生化指標(biāo)

小鼠末次灌胃24 h后使用乙醚麻醉，摘除眼球采血。待測血清樣品的制備：血樣于37 ℃靜置1 h、4 ℃放置3 h后，在4 ℃ 條件下3 000 r/min離心10 min制得血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩４郎y肝臟組織樣品的處理：取肝臟組織按質(zhì)量加入9倍的生理鹽水，在冰水條件下機械勻漿、制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的組織勻漿，在4 ℃ 條件下3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃保存、備用。測定前根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果取一定量上清液用生理鹽水稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的待測組織上清液,同時采用蛋白定量試劑盒測定上清液蛋白質(zhì)量濃度。

采用比色法測定小鼠肝臟和血清中的GOT、GPT的酶活力以及小鼠血清中TBIL、BUN含量，血清中的生化指標(biāo)可直接取樣進行測定，肝臟組織的生化指標(biāo)需經(jīng)過處理后再按相同的方法進行測定。

1.2.7.1 肝臟和血清中GOT酶活力的測定

測定管：分別添加0.1 mL樣品和0.5 mL基液，于37 ℃水浴加熱30 min后加入0.5 mL 2,4-二甲基苯肼溶液，同樣于37 ℃水浴加熱20 min，最后加入5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液混勻，室溫放置5 min，以雙蒸水調(diào)零后于505 nm處測定OD測定管。

對照管：添加0.5 mL基液，于37 ℃水浴加熱30 min后加入0.5 mL 2,4-二甲基苯肼溶液和0.1 mL樣品，同樣于37 ℃水浴加熱20 min，最后加入和5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液混勻，室溫放置5 min，以雙蒸水調(diào)零后于505 nm處測定OD對照管。

絕對OD值=OD測定管-OD對照管，根據(jù)絕對OD值查標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=a+bx+cx1.5+dx3；a=0.000 600 822 1，b=0.004 833 559 5，c=0.000 245 779 51，d=9.741 058 2E-09)，得到血清中GOT酶活力(U/L)。

按公式(3)計算肝臟中GOT酶活力(U/g)：

(3)

1.2.7.2 肝臟和血清中GPT酶活力的測定

測定管和對照管的試劑添加以及測定方法同1.2.7.1小節(jié)，根據(jù)絕對OD值查標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=a+bx+cx1.5+dx2+ex3；a=-5.587 264 8E-05，b=0.003 129 920 9，c=0.000 210 366 26，d=2.854 875 5E-05，e=4.450 846 3E-08)，得到血清中GPT酶活力(U/L)。按公式(4)計算肝臟中GPT酶活力(U/g)：

(4)

1.2.7.3 血清中TBIL含量的測定

測定管：分別添加8 μL樣品和240 μL試劑一，37 ℃孵育5 min后測定450 nm處的吸光度值OD0；再加入60 μL試劑二混勻，37 ℃孵育5 min后測定450 nm處的吸光度值OD1，ΔOD測定管=OD0-OD1。

對照管：以雙蒸水代替樣品作為對照，其余條件與測定管一致，同樣計算出ΔOD對照管。按公式(5)計算血清中TBIL含量(μmol/L)：

TBIL含量=887.211×(ΔOD測定管-ΔOD對照管)+0.549 2

(5)

1.2.7.4 血清中BUN含量的測定

測定管：分別添加0.02 mL樣品、1 mL試劑一和1 mL試劑二，準(zhǔn)確沸水浴15 min后立即用流水冷卻，并測定520 nm處吸光度值。

標(biāo)準(zhǔn)管：分別添加0.02 mL 10 mmol/L BUN標(biāo)準(zhǔn)溶液、1 mL試劑一和1 mL試劑二，準(zhǔn)確沸水浴15 min后立即用流水冷卻，并測定520 nm處吸光度值。

對照管：分別添加0.02 mL 雙蒸水、1 mL試劑一和1 mL試劑二，準(zhǔn)確沸水浴15 min后立即用流水冷卻，并測定520 nm處吸光度值。并按公式(6)計算血清中BUN含量(mmol/L)：

樣品稀釋倍數(shù)

(6)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素敏感性

由于抗生素抗性基因可在食品或腸道內(nèi)轉(zhuǎn)移，因此用于食品的乳酸菌耐藥性評價也已成為安全性評價的首要內(nèi)容。本研究選擇常用的抗生素藥敏紙片氟哌酸、頭孢拉定、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素和紅霉素，無菌添加于涂布L.plantarumPMO的MRS平板培養(yǎng)24 h。其抑菌圈大小及對抗生素敏感程度如表1所示。根據(jù)《CLSI抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)》標(biāo)準(zhǔn)判定，L.plantarumPMO對這些抗生素高度敏感。JIANG等[14]對L.plantarumWLPL04進行抗生素敏感性評價，結(jié)果表明WLPL04菌株對紅霉素、氯霉素、慶大霉素和阿莫西林等敏感，但對卡那霉素、環(huán)丙沙星等具有抗性。SINGH等[15]對嬰兒糞便中提取出的羅伊氏乳桿菌Lactobacillusreuteri菌株進行抗生素敏感性測試，發(fā)現(xiàn)菌株對氯霉素、紅霉素敏感，但對慶大霉素等具有耐藥性。相比而言，L.plantarumPMO安全性較高，應(yīng)用時需避免與抗生素接觸以免失活。

表1 L. plantarum PMO抗生素敏感性測定結(jié)果Table 1 Antibiotic sensitivity results of L. plantarum PMO

2.2 一般體征觀察與急性毒性

以低、中、高濃度的L.plantarumPMO連續(xù)灌胃21 d，小鼠生長和精神狀態(tài)良好、毛色光亮；飲食、飲水、排泄及活動正常，無中毒或死亡狀況發(fā)生；解剖后肉眼觀察各臟器無異常情況。灌胃期間各組小鼠體重變化如圖2所示，雄鼠體質(zhì)量(約43 g)均顯著高于雌鼠(約33 g)(P<0.05)，但各劑量組與對照組間無顯著差異(P>0.05)。這些情況表明L.plantarumPMO對小鼠生長無顯著影響。根據(jù)GB 15193.3—2014《急性經(jīng)口毒性試驗》可認(rèn)為L.plantarumPMO的半數(shù)致死量(LD50)>5×1011CFU/mL(bw)，20 mL/(kg·d)，為實際無毒級別。最大耐受劑量>5×1011CFU/mL(bw)，20 mL/(kg·d)。

圖2 L. plantarum PMO對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of L. plantarum PMO on body mass of mice 注:不相同字母表示差異顯著(P<0.05); 相同字母表示差異不顯著(P>0.05)(下同)

2.3 細菌易位

細菌易位指細菌從胃腸道穿越腸道屏障到達血液、肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)等組織[16]。目前認(rèn)為腸道細菌易位的發(fā)生涉及機體免疫功能狀態(tài)[17]，腸黏膜上皮細胞等物理屏障和腸淋巴上皮組織抗感染、抗過敏作用[18]，腸道細菌的過度生長及腸血供狀態(tài)[19]，巨噬細胞和細胞因子或炎性介質(zhì)的復(fù)雜作用等多方面因素，可能引起免疫系統(tǒng)不健全或腸黏膜屏障功能障礙人群的益生菌相關(guān)菌血癥。

通過MRS固體培養(yǎng)基和SS固體培養(yǎng)基對臟器表面、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、肝臟及血液的細菌的檢測結(jié)果顯示(表2)，這些部位及器官表面未檢測到活菌，表明L.plantarumPMO未能通過腸道屏障到達腸系膜淋巴結(jié)及腸腔外的其他器官，不會發(fā)生細菌易位現(xiàn)象。同時，SS培養(yǎng)基上無菌落生長，表明L.plantarumPMO也不會引起腸道內(nèi)沙門氏菌和志賀氏菌發(fā)生細菌易位的現(xiàn)象。

表2 不同劑量L. plantarum PMO的細菌易位試驗Table 2 Bacterial translocation in different tissues of mice treated with L. plantarum PMO

2.4 臟器指數(shù)

肝臟和腎臟為重要解毒器官，其指數(shù)的變化程度也可反映灌胃成分毒性的強弱。由圖3可知，各組小鼠灌胃后，心臟指數(shù)為0.50%～0.64%，肝臟指數(shù)為5.06%～5.55%，腎臟指數(shù)為1.53%～1.67%，脾臟指數(shù)為0.36%～0.39%。雖然各組雄鼠的心臟指數(shù)略低于雌鼠，肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)略高于雌鼠，但差異均不顯著(P>0.05)。灌胃L.plantarumPMO的小鼠與對照組小鼠的各臟器指數(shù)相比，未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)，表明L.plantarumPMO對小鼠各臟

a-心臟指數(shù)；b-肝臟指數(shù)；c-腎臟指數(shù)；d-脾臟指數(shù)圖3 L.plantarum PMO對小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.3 Effect of L.plantarum PMO on organ indexes of mice

器無損害作用。

2.5 生化指標(biāo)

2.5.1L.plantarumPMO對小鼠肝臟和血清中GOT酶活力的影響

臨床表明，GOT含量與肝臟損害程度呈現(xiàn)顯著相關(guān)性[20]，正常情況下，血清中GOT處于平穩(wěn)狀態(tài)，但心肌細胞和肝細胞受到損害時，GOT酶活力會隨損傷程度而升高，因此可作為心肌細胞和肝臟是否受到損害的重要評判指標(biāo)。

對小鼠肝臟GOT酶活力檢測結(jié)果如圖4所示，各劑量組與對照組間雖有差異，但差異不顯著(P>0.05)。對灌胃L.plantarumPMO小鼠血清GOT的檢測如圖5所示，雖然劑量組的酶活力發(fā)生變化(18.12～22.07 U/L)，但未見顯著差異(P>0.05)，因此認(rèn)為L.plantarumPMO不會對心肌細胞和肝細胞造成損害。

圖4 小鼠肝臟中GOT酶活力Fig.4 GOT activities in liver of mice

圖5 小鼠血清GOT酶活力Fig.5 GOT activities in serum of mice

2.5.2L.plantarumPMO對小鼠肝臟和血清中GPT酶活力的影響

GPT在血液中含量較少，主要存在于肝細胞漿。當(dāng)肝細胞腫脹、壞死或通透性增高時，GPT被釋放進入血液，且升高的GPT會導(dǎo)致肝細胞的進一步損傷。因此GPT被作為肝功能損害的評價指標(biāo)[21]。

小鼠肝臟GPT的測定結(jié)果如圖6所示，各組小鼠的肝臟GPT酶活力處于大致相同的水平(37.48～41.16 U/g)。劑量組小鼠因個體差異，血清GPT酶活力在一定范圍內(nèi)波動(圖7)，但與對照組無顯著差異(P>0.05)，表明L.plantarumPMO灌胃不會造成肝臟功能、心肌細胞及骨骼肌的損傷。

圖6 小鼠肝臟中GPT酶活力Fig.6 GPT activities in liver of mice

圖7 小鼠血清中GPT酶活力Fig.7 GPT activities in serum of mice

2.5.3L.plantarumPMO對小鼠血清中TBIL含量的影響

TBIL為直接膽紅素和間接膽紅素的總和。衰老的紅細胞釋放血紅蛋白,經(jīng)代謝形成膽紅素，包括游離膽紅素和結(jié)合膽紅素，分別經(jīng)尿液和糞便排出。正常情況，血液中僅含微量膽紅素，當(dāng)肝細胞異常時會引起高膽紅素血癥，因此可作為肝功能和膽功能的重要指標(biāo)[22]。小鼠血清TBIL的測定結(jié)果如圖8所示，各組TBIL含量在10.47～12.02 μmol/L波動，性別和劑量都無顯著差異(P>0.05)。因此可認(rèn)為L.plantarumPMO不會對肝功能和膽功能造成損害。

圖8 小鼠血清TBIL含量Fig.8 Content of TBIL in serum of mice

2.5.4L.plantarumPMO對小鼠血清中BUN含量的影響

BUN指血漿中除蛋白質(zhì)外的含氮化合物，是人體蛋白代謝的主要終產(chǎn)物，經(jīng)由腎小球過濾排出體外，腎功能不全時其含量升高。因此，血清BUN可作為判斷腎功能的指標(biāo)[23]。各劑量組小鼠的血清BUN含量在7.78～8.90 mmol/L范圍內(nèi)波動(圖9)，性別和劑量都無顯著差異(P>0.05)，表明L.plantarumPMO不會對腎功能造成損害。

圖9 小鼠血清BUN含量Fig.9 Content of BUN in serum of mice

3 討論

通過對植物乳桿菌L.plantarumPMO致病性和敏感性進行試驗，結(jié)果表明，連續(xù)灌胃21 d，小鼠無中毒或死亡狀況發(fā)生。根據(jù)GB15193.3—2014《急性經(jīng)口毒性試驗》 認(rèn)為最大耐受劑量>5×1011CFU/(mL·bw)，20 mL/(kg·d)。L.plantarumPMO對氟哌酸、頭孢拉定、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素和紅霉素高度敏感，不會發(fā)生細菌易位現(xiàn)象。臟器指數(shù)及生化指標(biāo)與對照小鼠無顯著差異，對肝臟、心臟、腎臟及膽道的細胞和功能沒有損害作用。

近年來，對于植物乳桿菌的安全性研究，在生物醫(yī)學(xué)及大健康領(lǐng)域備受關(guān)注。研究證實植物乳桿菌L.plantarumGUO[24]、L.plantarumC88[25]、L.plantarumF22[26]等具有較高的安全性。具有益生菌潛力的植物乳桿菌用作輔助發(fā)酵劑可提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性。GE等[27]從感官特性和理化指標(biāo)方面評價，發(fā)現(xiàn)將金華火腿中的L.plantarumNJAU-01作為發(fā)酵劑能夠改善干腌發(fā)酵香腸品質(zhì),這與研究表明L.plantarumT571能改善羊奶干酪品質(zhì)的結(jié)論一致[28]。VALIPOUR等[29]實驗證實了L.plantarumKC426951能調(diào)節(jié)小龍蝦的腸道菌群，改善一些免疫參數(shù)及消化酶的活性，可作為龍蝦養(yǎng)殖中的有益飼料。

隨著研究的深入，越來越多新型益生菌逐漸被用于醫(yī)藥保健、食品、飼料和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中，應(yīng)用前景廣闊。L.plantarumPMO具有良好的耐酸、耐低溫和耐膽鹽活性，作為益生乳桿菌具有良好的應(yīng)用前景。實驗表明，韓國泡菜中分離篩選的L.plantarumPMO對小鼠實驗呈現(xiàn)較高安全性，可用于后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)和深度利用。