響應面法優化海南眼樹蓮中三萜類化合物的提取工藝①

曾慧慧 樊自強 楊 莉 段永霞 葉 帆 楊 柳 余邦良

(海南醫學院藥學院 海南海口 571199)

眼樹蓮（Dischidia chinensis），別名瓜子金、瓜子藤、滴錫藤、石仙桃、小耳環、上樹瓜子、樹上瓜子、上樹鱉、翼魚草，為蘿藦科眼樹蓮屬附生藤本植物，生長在低海拔至中海拔的山地林谷或曠地，在中國主要產于海南、廣東和廣西等省區［1］。眼樹蓮全株入藥，有清肺化痰、涼血解毒之功效，民間用于治療肺燥咳痰、咳血、百日咳、小兒疳積、痢疾、疥瘡毒膿、跌打腫痛、毒蛇咬傷［2］。海南黎族地區用其全草煮水熏眼，治療眼疾［3］。霍麗妮等［4］研究了眼樹蓮全株中總酚和總黃酮的體外抗氧化活性。楊柳等［5-6］、洪家立等［7］、張天花等［8］發現海南產眼樹蓮不同提取物具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性。余邦良等［9］首次從眼樹蓮乙酸乙酯中分離得到10 個單體化合物，大部分為萜類化合物，但是提取率較低。據文獻［10-12］報道，萜類化合物具有一定抗腫瘤活性，目前未見關于應用響應面優化方法篩選眼樹蓮中三萜類化合物提取工藝的報道。

為了從眼樹蓮中獲取更多量的三萜類化合物，探討一種高效提取方法，前期通過對比索氏提取與超聲提取2種實驗方法，發現超聲法提取眼樹蓮中三萜類化合物得率更高，因此選用超聲波提取眼樹蓮中三萜類化合物。通過單因素和響應面法優化考察了各因素對提取得率的影響，期望建立一種快捷、簡便、高效的眼樹蓮三萜類化合物提取方法，為深入開發利用眼樹蓮奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥材和試劑

眼樹蓮藥材于2019 年3 月采自海南省海口市火山口地區，經海南大學劉壽柏副教授鑒定，其為蘿藦科植物眼樹蓮，編號為YSL-201812；齊墩果酸，HPLC≥98.5%（上海源葉生物科技有限公司）；無水乙醇、香草醛、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯、二甲苯均為分析純（廣東西隴化工試劑有限公司）。

1.1.2 儀器

LC-15C 高效液相色譜儀（日本島津）；722N可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；KQ5200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；TG16-WS 臺式高速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；SSW-600-2S 電熱恒溫水浴箱（上海博迅實業有限公司）；DFY-1000D 藥用粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；YRE-210D 型旋轉蒸發器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DHG-9095A 型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；C-YLS-Q4 型耳片打孔器（北京哲成科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取液的制備

采集新鮮的海南本地眼樹蓮，切段，曬干，用粉碎機粉碎，過40 目篩，獲得3 kg 粉末；稱取3.0 g眼樹蓮粉末，置于錐形瓶中，加入溶劑混勻，以不同的超聲功率、溫度、提取時間、液料比進行三萜類化合物的提取；超聲時間到了之后，抽濾得到提取液，超聲3次，合并濾液，備用［8］。

1.2.2 眼樹蓮中三萜類化合物的含量測定

1.2.2.1 齊墩果酸標準曲線的繪制

參考文獻［8，13-14］的方法，精密稱取齊墩果酸10.0 mg，以無水乙醇為溶劑，配制0.4 mg/mL 齊墩果酸溶液。量取0.2 mL 齊墩果酸溶液，于80℃水浴加熱至溶劑揮發完畢，加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.3 mL、高氯酸0.7 mL，搖勻；于70℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，加入4 mL乙酸乙酯搖勻，即為齊墩果酸標準溶液；將齊墩果酸標準溶液采用逐級稀釋法分別稀釋為12.0、10.0、8.0、6.0、4.0 μg/mL 的系列標準溶液；以560 nm為掃描波長，以系列齊墩果酸標準溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制一條標準曲線，得到線性方程及相關系數。

1.2.2.2 計算三萜類化合物得率

將1.2.1中所得眼樹蓮的三萜類化合物提取液成倍稀釋后，取稀釋后溶液5 mL，用1.2.2.1方法測定其吸光度值，記錄其吸光度值，根據以下公式，計算眼樹蓮三萜類化合物的得率［14］，用η表示。

式中：η，三萜類化合物得率；m，測得的吸光度在齊墩果酸標準曲線上顯示的齊墩果酸（μg）；c，稀釋倍數；M，樣品質量（g）。

前期實驗比較了多種溶劑的提取效果，發現將乙酸乙酯作為溶劑，提取眼樹蓮中三萜類化合物的得率較高，所以選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

1.2.3 單因素實驗

以眼樹蓮中三萜類化合物得率為考察指標，對超聲功率、提取溫度、提取時間、液料比進行單因素實驗，考察這4個因素對三萜類化合物得率的影響。分別精確稱取3.0 g 眼樹蓮粉末5 份，分成5 個實驗組，每個實驗組均根據1.2.1 方法獲取眼樹蓮中三萜類化合物提取液；每個實驗組分別取3 份提取液，按照1.2.2 方法平行測定其三萜類化合物的得率，求其平均值［15］。在固定提取溫度均為45℃，超聲浸提時間均為30 min，液料比為30︰1（mL/g）的條件下，分別考察不同超聲功率（100、150、200、250、300 W）對三萜類化合物提取得率的影響；再根據實驗確定的功率條件，考察不同提取溫度（40、45、50、55、60℃）對三萜類化合物提取得率的影響；隨后分別考察不同超聲提取時間（20、30、40、50、60 min）、不同液料比 （10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）對三萜類化合物提取得率的影響。

1.2.4 響應面優化實驗設計

基于單因素實驗，選用Design Expert 11 軟件，根據Box-Behnken 模型的實驗設計原理，以眼樹蓮中三萜類化合物得率為響應值，選擇超聲功率（A）、溫度（B）、時間（C）、液料比（D）4 個因素進行響應面實驗，平行測定3次，求眼樹蓮中三萜類化合物平均得率，篩選出最佳提取工藝條件［16］。響應面優化實驗因素和水平見表1。

表1 眼樹蓮中三萜類化合物響應面因素和水平表

1.2.5 實驗條件對比

分別采用響應面優化后的實驗條件（1#）與張天花等［8］優化后的實驗條件（2#）來提取眼樹蓮三萜類化合物，以得率為考察因素進行對比。

1.2.6 液相色譜鑒別［17］

1.2.6.1 色譜條件

Kromasil C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶0.2%磷酸水溶液（87∶13）；流速1.0 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫為室溫；進樣量為20μL。

1.2.6.2 供試品溶液的制備

采用響應面優化后的實驗條件（1#）與張天花等［8］優化后的實驗條件（2#），獲得眼樹蓮三萜類化合物，分別將其濃縮成浸膏，并用HPLC 級甲醇將其超聲溶解成2.00 mg/mL 的溶液，取上清液經0.22 μm 濾膜過濾后，作為供試品溶液A，供試品溶液B。

1.2.6.3 對照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸20 mg 置于10 mL 容量瓶中，并用HPLC 級甲醇將其溶解成2.00 mg/mL 的齊墩果酸溶液，作為對照品溶液。

1.2.7 抗炎活性實驗

根據單因素實驗和響應面優化實驗結果確定較好的一組提取工藝，用楊柳等［5］的“二甲苯所致小鼠耳腫脹抗炎模型”方法，考察三萜類化合物的抗炎活性。取30 只雄性昆明種小鼠，分3 組，每組各10只；以48 mg/kg給藥劑量，作為藥物組；以1%的羧甲基纖維素水溶液作為空白對照組；以500 mg/kg 阿司匹林給藥劑量，作為陽性藥物組。參照楊柳等［5］的方法，計算三萜類化合物的的耳腫脹抑制率。

1.2.8 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2016 作圖， SPSS19.0統計軟件進行數據統計，以p＜0.05為差異有統計學意義，采用Design-Expert 11 進行響應面優化設計。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

繪制標準曲線實驗結果表明，標準曲線線性方程為y＝0.022 4x＋0.063 8，R2＝0.999 5。經回歸分析可知，在4.0～12.0 μg/mL 濃度范圍內，齊墩果酸標準濃度與吸光度呈良好的線性關系，可用于計算三萜類化合物的得率。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 超聲功率對三萜類化合物得率的影響

由圖1 可知，超聲功率在200 W 以下，隨著提取功率的增加，三萜類化合物的得率也增大，至200 W 時三萜類化合物的得率達到最大值；功率為250 W 時，眼樹蓮中三萜類化合物的得率呈下降趨勢。可能是因為超聲功率在200 W 時，超聲波的空化作用與機械作用達到較好的結合點，眼樹蓮中三萜類化合物完全溶出［14］，故超聲功率選擇200 W為宜。

2.2.2 溫度對三萜類化合物得率的影響

由圖2 可知，超聲溫度＜55℃時，三萜類化合物得率隨著溫度升高而逐漸增加；超聲溫度＞55℃時，三萜類化合物得率有所下降。這是因為隨著提取溫度的上升，介質擴散速率加速，分子運動劇烈增加，有利于提升三萜類化合物的得率［18-19］。但溫度過高，會影響三萜類化合物結構的穩定性，從而導致得率下降［20］，故選擇提取溫度為55℃。

2.2.3 超聲提取時間對三萜類化合物得率的影響

由圖3可知，提取時間對眼樹蓮三萜類化合物的得率有一定影響。30 min時三萜類化合物的得率提高比較明顯，40 min時三萜類化合物得率達到最大值（14.53 mg/g），隨后三萜類化合物的得率不斷下降。由于剛開始物料與溶劑的接觸越來越充分，因此得率逐漸增加，但隨時間的延長，雜質的溶出增加，這可能降低了浸提速度［13-14］，因此選擇超聲提取時間40 min為宜。

2.2.4 液料比對眼樹蓮三萜類化合物得率的影響

由圖4可知，液料比對眼樹蓮三萜類化合物得率具有一定的影響。隨著液料比的增加，三萜類化合物得率呈先上升后下降的趨勢，當液料比達到30∶1（mL/g）時，眼樹蓮中三萜類化合物得率達到最高。前期由于液料比過低，料液粘稠增加，超聲波空化作用減小，不利于超聲波在溶劑中的傳播擴散［21］，所以隨著液料比的增加，眼樹蓮中三萜類化合物得率有所提高。但是液料比過大也會使溶劑和能耗增加，從而造成浪費，并增加下一步濃縮工序的難度［8，14，22］，故選擇提取液料比為30∶1（mL/g）。

2.3 響應面優化實驗結果

2.3.1 響應面模型建立與顯著性分析

基于單因素實驗結果，運用響應面法優化眼樹蓮三萜類化合物提取工藝［15］，響應面優化實驗結果見表2。利用Design-Expert11 軟件對實驗所得數據進行回歸分析，獲得以超聲功率（A）、溫度（B）、時間（C）、液料比（D）為因素水平，以眼樹蓮中三萜類化合物得率為評價指標（Y）的二次多項回歸方程式：Y＝20.736＋1.87A－1.77B＋1.49C＋1.38D－0.982 5AB＋0.422 5AC＋1.51AD－0.547 5BC＋1.06BD＋0.955 0CD－2.82A2－3.05B2－2.06C2－3.15D2

表2 響應面優化實驗結果

利用方差分析進一步驗證模型的可靠性，實驗結果見表3。模型p值＜0.000 1，表明方程模型極其顯著，失擬項p值＞0.05，表明失擬不顯著，說明模型擬合程度較好［23-24］。用R2決定系數和R2Adj調整決定系數來檢查方程的擬合程度。實驗真實值與模型預測值的決定系數R2＝0.966 5、調整決定系數說明該模型擬合程度良好，可靠性較高，實驗值與預測值之間具有較高的關聯性［25］，可以利用該模型預測眼樹蓮三萜類化合物的最高得率；在所考察的獨立因素、因素間交互項及因素的二次項中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對眼樹蓮三萜類化合物得率影響極其顯著（p＜0.01），AB、AD、BD、CD對眼樹蓮三萜類化合物得率影響顯著（p＜0.05），這些因素對三萜類化合物得率影響較大，具有統計學意義，故認為4個因素不僅其簡單的線性關系影響著得率，而且其交互項、二次項對得率均有一定的影響。方差分析表中各因素的F值反映因素對響應值的重要性，F值越大，表明對響應值的影響越大，重要性越大［26］。經分析可知，各因素對眼樹蓮三萜類化合物得率影響程度大小順序為超聲功率（A）＞溫度（B）＞時間（C）＞液料比（D）。

表3 以三萜類化合物得率為響應值回歸模型方差分析

2.3.2 響應面交互作用分析及條件優化

曲面圖和等高線圖可以形象地反映響應值隨各因素的變化趨勢［26］。利用 Design-Expert11 軟件對上述實驗結果進行響應面分析，繪制出超聲功率、溫度、時間、液料比這4個因素之間的交互作用對三萜類化合物得率影響的響應面，可以得到該模型的響應面圖和等高線圖，見圖5。響應面圖的曲面曲線走勢越陡，表明兩因素的交互作用越顯著［27］。等高線為橢圓形表示兩因素的交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著［28］。從圖5可知，提取功率（A）與液料比（D）的等高線呈橢圓，且兩者的響應面圖形曲線走勢較陡，說明這兩因素對眼樹蓮三萜類化合物的得率影響極其顯著；提取功率（A）與提取溫度（B）、提取溫度（B）與液料比（D）、提取時間（C）與液料比（D）的等高線趨近于橢圓形，說明兩因素間交互作用對三萜類化合物得率影響顯著；提取功率（A）與提取時間（C）、提取溫度（B）與提取時間（C）的等高線均趨向圓形，說明兩個因素間的交互作用對三萜類化合物得率影響不顯著。以上響應面圖形分析結果與方差分析（表3）相符合。根據建立的模型進行參數優化分析，以得率的最高值為優化目標，得最優工藝為：超聲功率225.57 W、溫度48.25℃、時間45.23 min、液料比23.55∶1（mL/g）。根據實驗條件進行修正：超聲功率225 W、溫度48℃、時間46 min、液料比為23∶1（mL/g），并按照響應面優化后的條件采用含量測定方法進行驗證實驗，實驗結果見表4，所得得率平均值為22.12 mg/g，RSD為0.3%，預測值22.20 mg/g，預測值與實際值誤差較小，說明響應面優化模型可靠，結果表明該實驗條件具有重現性、可控性。

表4 眼樹蓮中三萜類化合物驗證實驗結果

2.4 條件對比實驗結果

分別利用響應面優化后的實驗條件（1#）與張天花等［8］優化后的實驗條件（2#）提取三萜類化合物，2種方法的得率大小對比實驗結果見表5。結果表明，響應面優化的實驗條件得率較高，實驗溫度條件較為溫和。

表5 兩種種實驗條件提取三萜類化合物的得率比較結果

2.5 高效液相色譜鑒別結果

分別將1#和2#工藝提取得到眼樹蓮中三萜類化合物及齊墩果酸按照1.2.6.1的實驗條件進行液相色譜測定，液相色譜圖見圖6。從圖6 可知其均含有相同出峰時間的物質，說明眼樹蓮中含有三萜類提取物。

2.6 抗炎活性實驗結果

實驗結果見表6。眼樹蓮中三萜類化合物能夠抑制小鼠耳腫脹，與空白對照組比較，耳腫脹抑制率為69.1%，說明眼樹蓮中三萜類化合物具有抗炎活性。

3 討論與結論

3.1 討論

目前，關于植物三萜類化合物提取工藝的研究報道較多［14-16，18，21-23］，但對眼樹蓮三萜類化合物提取工藝的研究較少。李志等［14］采用超聲波輔助法對薏苡仁中三萜化合物提取工藝進行研究發現，該方法得率較高，且設備簡單。蘇元元等［16］采用Box-Benhnken 響應面分析法通過優化獲得簡單、高效的提取夏枯草中三萜類化合物工藝。呂蘇珊［29］采用Box-Benhnken 響應面分析法優化蘿藦科黑骨藤皂苷類成分提取工藝，得到相關可靠參數。綜上研究可以看出，蘿藦科眼樹蓮三萜類化合物提取工藝可采用超聲波輔助提取及Box-Benhnken響應面分析法優化。響應面分析是通過設計合理實驗的方法，運用多元二次回歸方程來擬合因素和響應值的關系，尋找最佳響應值的統計方法［30］。響應面分析法與傳統的正交設計相比，既能體現提取過程中不同因素之間的交互作用關系，又能更加精確地篩選出最佳提取工藝，對于非線性響應因素的預測具有較強的指導性，應用價值

較高［31］。

表6 眼樹蓮中三萜類化合物抗炎活性實驗結果

3.2 結論

本研究在單因素的基礎上，選擇對三萜類化合物得率影響較大的因素，通過響應面分析法對眼樹蓮三萜類化合物提取工藝進行優化，最后確定其最佳提取工藝：超聲功率225 W、溫度48℃、時間46 min、液料比為23∶1（mL/g），在此條件下，眼樹蓮的三萜類化合物得率可達到22.12 mg/g，得率明顯高于張天花等［8］用正交法優化的條件。獲取的三萜類化合物經高效液相色譜鑒定可知其含有三萜類物質，通過小鼠耳腫脹實驗可知其具有一定抗炎活性。本研究結果說明該工藝具有較好的應用價值，為深入研究眼樹蓮提供一定的參考價值和理論依據。