CIP方法清除乳品生產設備中金黃色葡萄球菌生物被膜的研究

王灝然 蔣淼 高印朝

摘 要：金黃色葡萄球菌是一種常見的引起中毒的革蘭氏陽性菌。該菌對溫度、鹽分具有一定的耐受能力，生長范圍較廣，例如土壤、動物的皮毛和排泄物中。該菌引起食品中毒的腸毒素在食品加工過程中如果無法及時清除很容易導致食品問題。[1]為此，可以采用CIP這種方法去除食品加工設備上的金黃色葡萄球菌生物被膜。本實驗旨在探究CIP殺菌方法對金黃色葡萄球菌的殺菌效果。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌;金黃色葡萄球菌生物被膜;CIP;乳品生產

金黃色葡萄球菌為球形，直徑在0.8μm左右，經顯微鏡觀察呈葡萄串類似的形狀。葡萄球菌無芽孢和鞭毛，在個金黃色葡萄球菌培養的過程中，需氧或堿性厭氧條件，最適合的培育環境為37℃，pH應該控制在7.4左右[2]。金黃色葡萄球菌腸毒素是世界性衛生問題，乳品尤其是原料乳極易受到金黃色葡萄球菌的污染，在中毒之后會導致人體的腸胃壁受神經器刺激，出現惡心、嘔吐等中毒反應。[3]

生物被膜（Biofilm，BF）是指細菌在接觸物表面分泌多糖基質、纖維蛋白、脂質蛋白等多聚物構成胞外基質，將其自身包裹在其中，這是微生物為適應外界環境二=而形成的一種生存策略。在不銹鋼、鋁等乳品加工設備表面極易形成金黃色葡萄球菌生物被膜。[4]

各種現代化的食品生產技術大量的應用導致食品污染因素更加復雜。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件越來越多，尤其是在乳品生產領域。在此背景下，我們探究一種原位就地清洗方法CIP（Cleaning in palce）清除金黃色葡萄球菌生物被膜的效果，旨在為CIP作為一種新型方法清除乳制品加工管道中的金黃色葡萄球菌生物被膜提供理論依據。[5]

一、材料與方法

1.1菌株、材料與試劑

本實驗所用菌種為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 29213）、胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone Soya Broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（Tryptone Soya Agar，TSA）培養基、PBS溶液、1.5%NaOH溶液、0.5%HNO3溶液、恒溫水浴鍋。

1.2實驗方法

劃金黃色葡萄球菌ATCC 29213于TSA培養基，經37°C恒溫培養24 h。挑取單菌落于30 mL胰蛋白胨大豆肉湯TSB中，置于37°C恒溫搖床（130 rpm）培養8 h。將培養8 h的菌懸液離心（8000 × g，10 min，4°C），用PBS清洗菌體兩次，并用PBS重懸浮，稀釋菌懸液至OD630 nm = 0.4，此時菌體濃度2×108 CFU/mL。

將菌懸液稀釋10倍后，分裝于50 mL含不銹鋼片（2 cm×5 cm）的離心管中，不銹鋼片用于模擬乳制品生產的金屬管道，每管30 mL菌懸液，并置于4°C條件下培養24 h，使菌體黏附于不銹鋼材料表面。24 h后將不銹鋼片在無菌水中漂洗兩次，放入裝有30 mL TSB的50 mL離心管中，于25°C條件下培養3 d，使金黃色葡萄球菌形成成熟生物被膜。

將成熟的金黃色葡萄球菌生物被膜用無菌水清洗兩次，根據Rangi Priyanka等人報道的方法[6]，在70°C下用30 mL的1.5%NaOH溶液處理5 min，將不銹鋼片用無菌水清洗兩次，再在60°C下用30 mL的0.5%HNO3溶液處理5 min，將不銹鋼片取出，在無菌水中清洗后置于含有30 mL PBS溶液的離心管中渦旋，使不銹鋼片上的菌體充分脫落。隨后吸取1 mL吹打均勻的菌液梯度稀釋，并分別吸取各稀釋梯度的樣品100 ?L涂布至TSA平板。于37°C培養箱中培養24 h，計算菌落數量。

二、結果

通過CIP清洗的方式，不銹鋼片上的生物被膜已完全下降至檢出限以下，說明CIP清潔較為有效的殺滅了金黃色葡萄球菌生物被膜中的活菌。

通過清洗液的化學作用、物理作用和在流動過程的機械沖刷作用達到CIP過程中的殺滅細菌生物被膜中的活菌的效果。在堿洗滌中去除蛋白質和碳水化合物，破壞金黃色葡萄球菌生物被膜的胞外基質;在酸洗滌中，可除去設備表面堿性產物，提供抑菌條件，從而抑制任何殘留微生物的生長。

我們的研究結果表明，在有機殺菌劑濫用的今天，CIP清洗方案是一種新的食品清潔策略，可將生物被膜的活菌量降至檢出限以下，最大限度地減少金黃色葡萄球菌生物被膜污染，從而減小污染、降低成本、縮短清潔時間并提高清潔效率。

參考文獻

[1]鐘軍華.食品中金黃色葡萄球菌檢測方法的比較研究[J].現代食品，2019（23）：147-148+152.

[2]趙效南，苑曉萌，張印，胡明，王文博，劉玉慶.山東省生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌的污染狀況及耐藥性分析[J].山東農業科學，2019，（12）：1-8.

[3]董彬，封麗霞，馮曉，王紅坤，李春梅.乳品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌快速檢測的新體系[J].食品安全導刊，2017（34）：72-74.

[4]邢盼盼，鄧開野，李南薇.金黃色葡萄球菌生物被膜在食品工業領域的研究進展[J].食品工業，2012，33（12）：150-152.

[5]胡春林.液態食品生產過程微生物控制方法的淺析[J].食品工業，2017，38（07）：245-248.

[6]Rangi Priyanka，Minz P S，Deshmukh Gajanan P，Subramani P，Singh Ripudaman.Application of image analysis technique to determine cleaning of ohmic heating system for milk.[J].Journal of food science and technology，2019，56（12）.

（作者單位：西北農林科技大學）