蒙藥蘇門-6微生物限度檢查方法適用性試驗

閆秋霞 劉建明 杜美娜

摘?要：目的：建立蒙藥制劑蘇門-6的微生物限度檢驗方法。方法：按《中國藥典》2015年版四部非無菌產品微生物限度檢查法：控制菌檢查法進行適用性試驗。結果：供試品5種試驗菌回收比在0.5～2之間，控制菌均能正常檢出。

關鍵詞：蘇門-6;微生物限度;適用性試驗

本文參考相關文獻，根據蒙藥制劑中成分的抑菌作用強度不同，采用了平皿法（稀釋法）建立蘇門-6相應的微生物限度檢查方法，經方法適用性試驗證實該方法簡易有效。

1.實驗材料

1.1樣品名稱

蘇門-6，批號：20180725、20181227、20190509，具由新疆維吾爾自治區博爾塔拉蒙古自治州蒙醫醫院生產。

1.2儀器

SPX-150生化培養箱（江蘇揚州慧科電子有限公司）;GHP-9162電熱恒溫培養箱（江蘇揚州慧科電子有限公司）;BHC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）DHG-9245A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）PL602-L型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;GI54TW全自動高壓滅菌鍋（致微（廈門）儀器有限公司）;JLQ-S1菌落計數器（無錫縣金城儀器廠）;BHW-IV型電熱恒溫水浴鍋（北京市醫療設備廠）;JFC勻漿儀（漯河市金田試驗設備研究所）。

1.3培養基及稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號1704142）、胰酪大豆胨液體培養基（批號1703082）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號150824）、腸道菌增菌液體培養基（批號170216）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號150818）、麥康凱液體培養基（批號161228）、麥康凱瓊脂培養基（批號150907）、RV沙門增菌液體培養基（批號150912）木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（批號：170621）、pH7.0氯化鈉-蛋白胨水（批號20190129）。

1.4菌?種

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、沙門氏菌[CMCC（B）50094]以上培養基和菌種均由中國食品藥品檢定研究院提供工作菌株為第3代。

2菌液及供試液制備

2.1菌液制備

取經35℃培養18-24小時的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌胰酪大豆胨液體培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經35℃培養18-24小時的大腸艾希氏菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌胰酪大豆胨液體培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于100cfu/ml的菌懸液;取經25℃培養2-3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經25℃培養5-7天黑曲霉的新鮮培養物加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于10000cfu/ml的孢子懸液。

2.1供試液制備

取樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，制成1：10的供試液;取1：10的供試液10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50ml，制成1：50的供試液。

3.需氧菌總數和霉菌及酵母菌總數計數檢查方法適用性

供試液分別加入上述5種代表性實驗菌株，再加15-20ml規定的瓊脂培養基待凝固后，置規定溫度培養24-72小時，觀察結果，平板計數，測定回收比值。

試驗組：取上述1：10、1：50供試液10ml加入0.1ml試驗菌，混勻，取含菌供試液1ml分別注入無菌平皿中，立即相應的瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。需氧菌總數計數的試驗菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌，相應的瓊脂培養基為胰酪大豆胨瓊脂培養基;霉菌和酵母菌總數計數的試驗菌株為沙氏葡萄糖瓊脂培養基。供試品對照組：取制備好的供試液，不加菌液，按試驗組計數方法，測定供試品本底菌數。菌液對照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行測定其菌數。結果如下：

測定結果顯示：該供試品用1：10的供試品按平皿法對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，回收比值小于0.5，采用1：50的供試品按平皿法對規定的菌株無明顯抑制作用，回收比值在0.5～2之間，該供試品需氧菌總數計數可采用1：50供試液按平皿法測定，霉菌及酵母菌總數計數可采用1：10供試液按平皿法測定。

4控制菌檢查方法適用性

4.1菌液制備

同計數方法適用性試驗，控制菌菌液計數如下：

4.2適用性試驗

大腸艾希氏菌?取1：10的供試液10ml，加入大腸埃希菌菌液1ml，加入100ml胰酪大豆胨液體培養基，混勻，置35℃培養18小時，取上述培養物1ml接種至100ml麥康凱液體培養基中，42℃培養24小時。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上35℃培養18小時，麥康凱瓊脂培養基應能檢出大腸艾希氏菌反應特征。

耐膽鹽革蘭陰性菌?取樣品1：10供試液100ml，置25℃培養2小時，取上述培養物10ml，加大腸埃希菌菌液、銅綠假單胞菌菌液各1ml，搖勻，接種至100ml腸道菌增菌液體培養基中，35℃培養24小時后，分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，35℃培養18小時，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上應能檢出耐膽鹽革蘭陰性菌的反應特征。

4.3上述結果表明，本品的控制菌檢查方法為：大腸艾希氏菌，取樣品1：10供試液10ml接種至胰酪大豆胨液體培養基中，培養基用量100ml;耐膽鹽革蘭陰性菌，取25℃培養2小時樣品1：10供試液10ml，接種至腸道菌增菌液體培養基，培養基用量100ml。

5、結論：

按《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查法、控制菌檢查法進行三次獨立適用性試驗，5種試驗菌回收比在0.5～2之間，控制菌均能正常檢出。

參考文獻

[1]?中國藥典通則四部[M].北京：醫藥衛生出版社

[2]?8種醫院制劑微生物限度檢查方法驗證[J].中國醫院藥學雜志

[3]?5種蒙藥醫院制劑微生物限度檢查方法建立及探討[J].食品安全質量檢測學報

論文來自課題《博州蒙藥制劑微生物限度檢驗方法的研究》