加味香砂六君子湯對胃癌大鼠的實驗研究

高華娟 黃小靖 郭麗宏 何文勝

摘要 目的：探究并分析加味香砂六君子湯通過抑制Wnt信號通路對胃癌大鼠樁蛋白（paxillin）、大鼠凋亡相關蛋白（RelA）表達的影響。方法：選取健康成年Wistar大鼠120只，按照隨機數字表法分為對照組和觀察組，每組60只，對2組大鼠進行胃癌造模處理，對照組大鼠又隨機分為未處理組、處理（生理鹽水）后8周組、處理（生理鹽水）后12周組，每組20只。觀察組大鼠又隨機分為未處理組、處理（湯藥）后8周組、處理（湯藥）后12周組，每組20只。觀察2組大鼠處理前、處理后8周、處理后12周paxillin、RelA。結果：2組大鼠處理前后體質量差異有統計學意義（P<0.05），2組大鼠處理前體質量比較差異無統計學意義（P>0.05），處理后，2組大鼠體質量有所降低，但觀察組大鼠降低程度明顯小于對照組（P<0.05）;2組大鼠處理前后wnt-1、paxillin、RelA水平差異有統計學意義（P<0.05），2組大鼠處理前wnt-1、paxillin、RelA水平比較差異無統計學意義（P>0.05），處理后，2組大鼠wnt-1、paxillin、RelA水平呈降低趨勢，但觀察組大鼠wnt-1、paxillin、RelA水平明顯小于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：加味香砂六君子湯能有效通過抑制wnt以降低胃癌大鼠paxillin、RelA的表達。

關鍵詞? 胃癌;大鼠;樁蛋白;大鼠凋亡相關蛋白;加味香砂六君子湯;信號通路;體質量;表達

Effect of Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction on Gastric Cancer Rats

GAO Huajuan¹， HUANG Xiaojing²， GUO Lihong¹，HE Wensheng¹

（1 fujian college of bioengineering， Fuzhou 350007， China; 2 Department of general surgery， fuzhou first hospital， Fuzhou 350000， China）

Abstract Objective：To explore and analyze the effect of Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction on the expression of paxillin （post protein） and RelA （apoptotic related protein） in gastric cancer rats by inhibiting Wnt signaling pathway.Methods：120 healthy adult Wistar rats were randomly divided into control group and observation group， 60 rats in each group.Gastric cancer modeling treatment were done for 2 groups of rats.Rats in control group were randomly divided into untreated group， 8 weeks after treatment （saline） group and 12 weeks after treatment （saline） group， 20 rats in each group.The rats in the observation group were randomly divided into untreated group， 8 weeks after treatment （decoction） group and 12 weeks after treatment （decoction） group， 20 rats in each group.Paxillin and RelA were observed before treatment， 8 weeks after treatment and 12 weeks after treatment of the two groups.Results：There was significant difference in the quality of rats between the two groups before and after treatment （P<0.05）.There was no significant difference in the quality of rats between the two groups before treatment （P>0.05）.After treatment， the quality of rats in the two groups decreased， but the degree of reduction in the observation group was significantly lower than that in the control group （P<0.05）.The levels of wnt-1， paxillin and RelA in the two groups before and after treatment were significantly different （P<0.05）.There was no significant difference in the levels of wnt-1， paxillin and RelA between the two groups before treatment （P>0.05）.After treatment， the levels of wnt-1， paxillin and RelA in the two groups decreased， but the levels of wnt-1， paxillin and RelA in the observation group were significantly lower than those in the control group （P<0.05）.Conclusion：Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction can effectively inhibit the expression of paxillin and RelA in gastric cancer rats by inhibiting wnt.

Keywords Gastric cancer; Rat; Pile protein; Rat apoptosis-related protein; Jiawei Xiangsha Liujunzi Decoction; Signaling pathway; Quality; Expression

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.009

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中發病率居首位，胃癌發病有明顯的地域性差別，在我國的西北與東部沿海地區胃癌發病率比南方地區明顯為高[1]。近年來，隨著人們生活節奏的加快以及生活壓力的逐漸增大，消化道腫瘤的發病率呈上升趨勢[2]。目前，胃癌的主要治療方式就是手術治療，但是對于部分尚未達到手術指針或者無法耐受手術的患者，藥物有著重要的治療作用。加味香砂六君子湯是一味常用的中藥，由黨參、白術、茯苓、陳皮等組成[3]。消化性潰瘍（胃及十二指腸潰瘍）、胃炎合并上消化道出血是中醫內科學常見的病癥，屬中醫內科“胃脘痛”“血證”的范疇。此外，加味香砂六君子湯對于脘腹脹滿、隱痛、噯氣、泛酸、畏寒怯冷、便溏、便頻等癥狀也有較好的效果。近來，有動物實驗發現，加味香砂六君子湯能有效調控大鼠胃黏膜癌癥相關因子的表達，可能有助于癌癥的治療[4]。為此，我們將加味香砂六君子湯用于胃癌模型大鼠的處理中，望探究其對胃癌大鼠的影響，現將報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康成年Wistar大鼠120只（清潔級，體質量180～220 g），使用C060滅菌的商品化大鼠飼料，自由飲水采食，自然光照，飼養溫度18～]25 ℃，飼養濕度60%～70%。本實驗通過醫學倫理學審查（倫理審批號：1702234）

1.1.2 藥物 加味香砂六君子湯配方：太子參]50 g、白術50 g、茯苓50 g、半夏50 g、陳皮50 g、木香50 g、甘草50 g、砂仁50 g、黃芪30 g、竹茹30 g、刺五加30 g、半枝蓮10 g、莪術10 g，共計510 g。配自遼寧中醫藥大學附屬第一醫院藥局，生產批號：H2182322。

1.1.3 試劑與儀器 N-甲基-N-亞硝基-N-硝基胍（MNNG，購自日本東京化成工業株式會社，批號：h2173722）;雷尼替丁（江西匯仁藥業有限公司，批號：yn18392ag007）。維酶素片（北海陽光藥業有限公司，批號：yg166304）。兔抗人PTEN（批號：1862831）、FAK（批號：18239G04）、paxillin單克隆抗體（批號：72160703-8）購于ABcam公司;Anti-PTEN抗體（批號：1727se18329），Anti-FAK抗體（批號：Y22173829N），Anti-paxillin抗體（批號：1626173HX301），通用型SP試劑盒SP-9000（批號：36268319），DAB顯色試劑盒（批號：H237623812）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將Wistar大鼠120只按照隨機數字表法將其分為對照組和觀察組，對2組大鼠進行胃癌造模處理，對照組大鼠又隨機分為未處理組、處理（生理鹽水）后8周組、處理（生理鹽水）后12周組，每組20只。觀察組大鼠又隨機分為未處理組、處理（湯藥）后8周組、處理（湯藥）后12周組，每組20只。大鼠之間體質量差異無統計學意義，進食狀態正常。造模方法：造模方法參考等人在研究[5]中的造模方法進行造模，造模處理2個月。

1.2.2 給藥方法 觀察組大鼠中未處理組直接處死。處理8周以及12周組大鼠給予加味香砂六君子湯10 g/kg，療程分別為8周以及12周，并分別于8周及12周處死。加味香砂六君子湯采取常規煎法，共煎出藥液200 mL，濃縮至100 mL（配置成生藥濃度為5 g/mL的水煎膏）。10 mL/瓶，高壓（0.1～0.15 kPa）20 min滅菌后，于4 ℃冰箱保存備用。對照組大鼠（未處理組）直接處死，其余大鼠給予生理鹽水1 mL灌胃（0.5 g/kg），1次/d，處理8周以及12周組大鼠分別于8周以及12周處死。

1.2.3 檢測指標與方法 所有大鼠處死后對胃癌組織進行活檢，并送病理檢查。胃黏膜Wnt信號通路關鍵因子Wnt-1采用Real Time PCR技術檢測，Paxillin、RelA表達采用免疫組化法測定，RelA水平采用平均光密度表示。實驗室檢查由我院兩名檢驗科人員操作，試驗相關試劑及試劑盒由我院中心實驗室提供。觀察2組大鼠處理前、處理后8周、處理后12周質量、wnt-1表達、paxillin、RelA表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。經統計分析，所得數據均符合正態分布。采用t檢驗以及重復方差分析統計計量資料;采用卡方檢驗統計計數資料，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組大鼠質量比較 2組大鼠處理前后體質量差異均有統計學意義（P<0.05），2組大鼠處理前體質量比較差異無統計學意義（P>0.05），處理后，2組大鼠體質量呈下降趨勢，但觀察組大鼠體質量明顯大于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 2組大鼠wnt-1表達比較 2組大鼠處理前后wnt-1差異有統計學意義（P<0.05），2組大鼠處理前wnt-1比較差異無統計學意義（P>0.05），處理后，2組大鼠wnt-1呈降低趨勢，但觀察組大鼠wnt-1明顯小于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 2組大鼠paxillin水平比較 2組大鼠處理前后paxillin水平差異有統計學意義（P<0.05），2組大鼠處理前paxillin水平比較差異無統計學意義（]P>0.05），處理后，2組大鼠paxillin水平呈降低趨勢，但觀察組大鼠paxillin水平明顯小于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3，圖1。

2.4 2組大鼠RelA水平比較 2組大鼠處理前后RelA水平差異有統計學意義（P<0.05），2組大鼠處理前RelA水平比較差異無統計學意義（P>0.05），處理后，2組大鼠RelA水平呈降低趨勢，但觀察組大鼠RelA水平明顯小于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4，圖2。

3 討論

香砂六君子湯由黨參、白術、茯苓、炙甘草、陳皮、制半夏、廣木香、砂仁所組成，曾改名為健脾和胃湯[6]。該方重點和胃暢中，治療脾胃虛弱、脘腹脹滿、隱痛、噯氣、泛酸等癥。目前常用于治療消化性潰瘍、胃炎等，本方如加黃芪，以參、芪補氣攝血;加炮姜，溫中止血，《本草經讀》：“中者土也，土虛則寒，而此能溫之[7]。止血者，以陽虛則陰必走，得暖則血自歸經也”。香附有行血中之氣，止血而不留瘀。本方益氣健脾統血，溫胃散寒止血，臨床運用效果確切，且能治療脾胃虛寒諸癥，增強脾胃運化功能。為此，筆者將其用于胃癌大鼠并探究其對胃癌大鼠的腫瘤相關指標表達的影響。

Wnt信號傳導途徑是一組信號轉導途徑，其以蛋白質開始，所述蛋白質通過細胞表面受體將信號傳遞到細胞中[8-9]。Wnt信號途徑用的只有2種信號傳導方式：胞間交流（旁分泌）或者相同細胞的交流（自分泌）。這些信號通路都在動物中在遺傳上是高度保守的，這也意味著它們在動物種間時很相似的。

Paxillin是一種蛋白質，在人類由編碼PXN基因。Paxillin在表達黏著斑非橫紋肌細胞中，并在costameres的橫紋肌細胞，以及其功能是黏附細胞的細胞外基質。PXN基因的突變以及Paxillin的異常表達與各種癌癥的進展有關。Paxillin已被證明在幾種癌癥類型的患者中具有臨床重要作用[10-11]。Paxillin的增強的表達已在癌前區域被檢測增生，鱗狀化生和杯狀細胞化生，以及發育異常的病變和癌的高風險患者的肺腺癌。RELA，也稱為p65，是參與NF-κB異二聚體形成，核轉位和活化的REL相關蛋白。RELA的磷酸化和乙酰化是NF-κB活化所需的關鍵翻譯后修飾，RELA也被證明可以調節免疫反應，RELA的激活與多種類型的癌癥正相關。作為NF-κB的原型異二聚體復合物成員，與p50一起，RELA在經典NF-κB活化和核轉位過程中與細胞質和細胞核中的各種蛋白質相互作用。

本研究中，2組大鼠處理前后質量差異有統計學意義（P<0.05），2組大鼠處理前質量比較差異無統計學意義（P>0.05），處理后，2組大鼠質量呈下降趨勢，但觀察組大鼠質量明顯大于對照組（P<0.05），此結果表明，加味香砂六君子湯能有效改善胃癌大鼠消化功能，減少大鼠體質量的下降。能有效降低胃癌大鼠paxillin、RelA的表達。You等[15]也在研究得出相似結論，這有可能與wnt信號通路的抑制有關。Cho等[14]也在研究中發現，加味香砂六君子湯能有效增加大鼠體質量，可能與改善大鼠消化功能有關。

本文證實了加味香砂六君子湯可以通過抑制Wnt信號通路影響胃癌大鼠paxillin、RelA的表達，為胃癌的病理生理學研究提供了相關研究證據。本文也有不足之處，如樣本數量，若需進一步研究加味香砂六君子湯對胃癌大鼠病理生理的影響，需要更大的樣本量的支持。

參考文獻

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