三七總皂苷對小鼠巨噬細胞炎性反應的影響

范盎然 于雪 王旭 王淑艷 陳紫微 魏鵬

摘要 目的：觀察三七總皂苷（PNS）對小鼠巨噬細胞炎性反應的治療作用，同時探討其可能機制。方法：通過蛋白質免疫印跡實驗、實時PCR法、酶聯免疫吸附試驗，對照研究PNS對小鼠巨噬細胞系RAW 246.7細胞中炎性反應調控因子過氧化物酶體增殖物激活受體-α（PPAR-α）以及其下游調控的炎性反應遞質腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應蛋白（CRP）和重組人巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），白細胞介素6（IL-6），炎性反應相關氧化因子誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和環氧化酶-2（COX-2）表達的影響。結果：小鼠巨噬細胞炎性反應模型制備后TNF-α、CRP、M-CSF、IL-6、iNOS及COX-2水平明顯上調，三七總皂苷給藥后，細胞炎性反應遞質與造模組比較有顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：三七總皂苷可明顯抑制小鼠巨噬細胞炎性反應效應，其作用機制可能通過激活調控因子PPAR-α實現。

關鍵詞? 巨噬細胞;炎性反應模型;小鼠;三七總皂苷;機制;過氧化物酶體增殖物激活受體-α;炎性調控因子;炎性相關氧化因子

Effects of Panax Notoginseng Saponins on Macrophage Inflammation in Mice

FAN Angran，YU Xue，WANG Xu，WANG Shuyan，CHEN Ziwei，WEI Peng

（School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University Of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To observe the therapeutic effects of Panax notoginseng saponins（PNS）on macrophage inflammation in mice and to explore its possible mechanism.Methods：By Western Blotting test，Real-time PCR method and Elisa test，the effects of PNS on the expression of inflammatory regulatory factors PPAR-α，TNF-α，CRP and M CSF，IL 6，iNOS and COX-2 in mice macrophages were comparatively studied.Results：After the establishment of mouse macrophage inflammation model preparations，the concentrations of TNF-α，CRP，M CSF，IL 6，iNOS and COX-2 were significantly up-regulated.After administration of Panax Notoginseng Saponins，the levels of inflammatory factors were significantly lower than those in the model group，and the differences are statistically significant（P<0.001）.Conclusion：Panax notoginseng saponins could significantly inhibit the inflammatory effects of macrophages in mice，and its mechanism may be realized by activating the regulatory factor PPAR-α.

Keywords Macrophage; Inflammation model; Mouse; Panax Notoginseng Saponins; Mechanism; PPAR-α; Inflammatory regulatory factor; Inflammatory related oxidative factor

中圖分類號：R282.6;R273 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.002〖HK〗

在血管中，慢性炎性反應是引起單核-巨噬細胞募集，繼而產生泡沫細胞的主要原因。主要由單核細胞被炎性反應遞質募集、巨噬細胞進入動脈壁炎性反應破損處并分泌釋放更多的炎性反應遞質和炎性反應相關氧化因子，使得低密度脂蛋白（LDL）被氧化成為氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、巨噬細胞攝取ox-LDL成為泡沫細胞死亡形成斑塊脂質核幾個過程組成。故而抑制這一最初的炎性反應在動脈粥樣硬化的防治中顯得尤為重要，抑制巨噬細胞炎性反應成為預防和治療動脈粥樣硬化方法[1-4]。

三七是臨床常用的中藥材，具有活血化瘀、消腫止痛的作用，臨床廣泛用于心腦血管疾病的治療[5-6]。三七總皂苷是三七的有效活性成分，臨床不少其有效治療動脈粥樣硬化的報道，但其作用機制目前尚無統一定論。我們以小鼠巨噬細胞系RAW 246.7作為模型，用動脈粥樣硬化危險因子ox-LDL造成巨噬細胞炎性模型，檢測抗動脈粥樣硬化因子過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α），炎癥遞質腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應蛋白（CRP）和重組人巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、白細胞介素6（IL-6），炎性相關氧化因子誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和環氧化酶-2（COX-2），并采用檢測炎性反應遞質TNF-α，試劑盒法檢測三七總皂苷對ox-LDL刺激RAW 246.7細胞的NO釋放的影響，由此探討三七總皂苷（Panax Notoginseng Saponin，PNS）的抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

小鼠巨噬細胞系RAW 246.7細胞，購自中國科學院上海細胞庫。數量：1×106個，以10% DMEM+90%胎牛血清凍存于液氮。

1.1.2 藥物

三七總皂苷，購自北京百諾威公司，批號：110870，共100 mg。

1.1.3 試劑及儀器

DMEM高糖細胞培養基（Hyclone，批號：MD207-050），FBS胎牛血清（PAA，批號：FBS500-S），ox-LDL（北京協生生物科技有限責任公司，批號：38293）及LDL（北京協生生物科技有限責任公司，批號：31342），SYBR Green realtime PCR混合液（Takara，日本，批號：RR420A）。自動平衡離心機（湘儀公司，TDZ5-W型），CO2細胞培養箱（日本SANYO公司，BC-J80/160S型），單人凈化工作臺（蘇州凈化，SW-CJ-1BU型），DU800核酸蛋白測定儀（BECKMAN COULTER，美國，DU800型），熒光定量PCR儀（ABI，美國，7300型），微孔板化學發光檢測儀（Berthold，德國，OrionII型），冷凍離心機（SIGMA，美國，Sigma3K15型），Trizol（Invitrogen，美國，批號：15596-026），逆轉錄試劑盒（Toyobo，日本，批號：QRA-201）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將小鼠巨噬細胞系RAW264.7用含10%胎牛血清的DMEM培養基，放置在37 ℃，5% CO2培養箱中培養，取對數期細胞用于實驗。傳代接種于6孔細胞培養板中，待細胞穩定融合至80%時，培養液中加入ox-LDL，使其終濃度為50 μg/mL。

1.2.2 給藥方法

將成模細胞分為2組，模型組及給藥組，將PNS預先加入到完全培養基中干預1 h，預先加入到完全培養基中干預1 h，隨后加入給藥組RAW264.7孵育8 h，每組設復孔。

1.2.3 檢測指標及方法

酶聯免疫吸附試驗檢測TNF-α、CRP、IL-6、iNOS和COX-2表達水平變化：干預結束后收集細胞上清液，置離心管中用2 000 r/min離心20 min，吸取上清液，用酶聯免疫吸附試驗檢測TNF-α、CRP、IL-6、iNOS和COX-2蛋白的水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

蛋白質免疫印跡檢測PPAR-α、M-CSF蛋白水平變化：干預結束后收集細胞，加入適量的細胞裂解液，室溫下靜置10 min后將細胞置于4 ℃ 2 000 r/min離心20 min，取出上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物公司，批號：2839392）測定各樣本的蛋白濃度并計算出上樣量。經電泳SDS-PAGE凝膠將目的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），滴加PPAR-α、M-CSF及β-actin一抗（購自美國CST公司，濃度均按照1∶1 000稀釋），脂奶粉封閉PVDF膜2 h，用PBS洗滌PVDF膜3次，5 min/次，加入HRP-二抗，置于室溫輕搖1 h后取出再用PBS洗滌3次。最后進行曝光、顯影、定影、拍照和統計分析。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 5統計軟件分析，檢測數據用均數±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三七總皂苷給藥后細胞炎性反應遞質的變化

造模后，細胞中的炎性反應遞質TNF-α、CRP和M-CSF、IL-6，炎性相關氧化因子iNOS和COX-2表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），而三七總皂苷給藥后，細胞炎性反應遞質與造模組比較顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 三七總皂苷給藥對細胞炎性反應遞質TNF-α蛋白水平的影響

PNS給藥后，RAW264.7細胞中的炎性反應遞質TNF-α蛋白比較模型組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 三七總皂苷給藥對細胞NO釋放量的影響

炎性刺激下，細胞對NO的釋放量升高，而PNS可以有效地使RAW264.7的NO釋放水平降低，趨于正常。見圖3。

2.4 三七總皂苷給藥后細胞炎性調控因子PPAR-α的變化

RAW264.7在受到刺激產生炎性反應時，伴隨炎性調控因子PPAR-α的表達顯著下調，差異有統計學意義（P<0.05），而給予PNS治療后，炎性調控因子PPAR-α的表達明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

慢性炎性反應是一個重要的公共健康問題，是多種疾病的潛在誘因，它引發的疾病可累積多個器官。如發生在血管的慢性炎性反應，是動脈粥樣硬化（AS）的重要誘因。由于其發展時間長，病程緩慢，慢性炎性反應往往不容易被人所察覺。在治療上，現代醫學采取的抗炎消炎治療并不能很好的解決此類炎性問題，還會帶來各種不良反應，嚴重降低患者的滿意度，不適宜長期使用。近年來，中醫藥得到了廣泛的普及。三七是其中最常用的中藥，因為它的作用已被多個實驗證實：如促進血液

循環、血管保護[7]，神經功能改善[8]，降低氧化應激[9]，以及抗炎作用。三七總皂苷（Panax Notoginseng Saponin，PNS）是三七的主要有效成分。動物實驗表明，PNS在心血管疾病中具有重要的作用[10-11]。現在它的部分產品可作為在中國和世界范圍內的非處]方藥。

[10]Chen S，Liu J，Liu X，et al.Panax notoginseng saponins inhibit ischemia-induced apoptosis by activating PI3K/Akt pathway in cardiomyocytes[J].J Ethnopharmacol，2011，137（1）：263-270.

[11]Yue QX，Xie FB，Song XY，et al.Proteomic studies on protective effects of salvianolic acids，notoginsengnosides and combination of salvianolic acids and notoginsengnosides against cardiac ischemic-reperfusioninjury[J].J Ethnopharmacol，2012，141（2）：659-667.

[12]王文曉，于靜，王攀峰，等.急性冠脈綜合征患者不同調脂方案的成本-效果分析[J].中國藥物經濟學，2019，14（8）：26-29，57.

[13]宋明慧.瑞舒伐他汀對急性冠脈綜合征介入術后腦鈉肽、基質金屬蛋白酶-9、可溶性細胞黏附分子、心型脂肪酸結合蛋白的影響[J].中國藥物經濟學，2018，13（8）：70-73.

[14]Gerits N，Kostenko S，Moens U.In vivo functions of mitogen-activated protein kinases：conclusions from knock-in and knock-out mice[J].Trans Res，2015，16（10）：281-314.

[15]Baker RG，Hayden MS，Ghosh S.NF-κB，inflammation，and metabolic disease[J].Cell Metab，2011，13（1）：11-22.

[16]Fan JS，Liu DN，Huang G，et al.Panax notoginseng saponins attenuate atherosclerosis via reciprocal regulation of lipid metabolism and inflammation by inducing liver X receptor alpha expression[J].J Ethnopharmacol，2012，142（3）：732-738.