響應面法優化乳雙歧桿菌Z-1 高密度發酵培養基

徐顯睿 李翠鳳 張宗博 李道河 隋勇軍 陳政言 張蘭威

（1青島根源生物技術集團有限公司食品實驗室，山東青島 266000） （2青島諾和諾康實業有限公司，山東青島 266000）（3中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266000）

乳雙歧桿菌具有調節腸道，促進腸道健康，提高免疫力，抑制有害菌生長和預防胃腸疾病等多種生理功能。為了將乳雙歧桿菌產業化并用于乳品、保健品和各類功能食品中，通常采用高密度培養方式提高菌體活菌數，獲得盡可能高的體積生產率。高密度培養是通過較短的發酵周期和較低的發酵體積，從而降低益生菌產業化成本，加快益生菌相關產品的商業化發展進程，進而提高產品的市場競爭力。因此對于益生菌功能性食品，乳酸菌高密度培養技術極其關鍵。

乳雙歧桿菌Z-1 是一株經篩選具有潛在益生功能的菌株，具有較強的耐胃酸、耐腸液能力和細胞黏附性。本試驗對乳雙歧桿菌Z-1 的培養基進行系統化分析，優化發酵培養基，以期對乳雙歧桿菌Z-1 凍干菌粉的產業化提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乳雙歧桿菌Z-1（Bifidobacteriumlactis Z-1），由青島根源生物技術集團有限公司食品實驗室菌種資源庫保藏。葡萄糖、蔗糖、乳糖、大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、檸檬酸銨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉、吐溫80、L-半胱氨酸鹽酸鹽，均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；胡蘿卜汁，福建綠泉食品有限公司；玉米漿，廣西百果園果汁有限公司；麥芽汁，煙臺麥特爾生物技術有限公司；莫匹羅星鋰鹽，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；瓊脂，北京索萊寶科技有限公司。

改良MRS 液體培養基：葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、牛肉膏1%、磷酸氫二鉀0.12%、檸檬酸銨0.26%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.005%、吐溫80 0.15%、L-半氨酸鹽酸鹽0.1%。

乳雙歧桿菌固體計數培養基：乳糖2%、胰蛋白胨0.5%、大豆蛋白胨1.5%、酵母膏0.3%、牛肉膏0.4%、吐溫80 0.1%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1%、莫匹羅星鋰鹽0.005%、瓊脂1.5%。

1.1.2 主要儀器設備

YXQ-LS-50SⅡ型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1F 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；AG050 型，厭氧培養罐：廣州雷得生物技術有限公司；SE6001FZH，電子天平美國奧豪斯公司；MEI04E型，分析天平梅特勒托利多公司；PHS-3C 型，pH計上海儀電科學儀器股份有限公司；LRH-250 型，生化培養箱上海一恒科學儀器有限公司；MX-S 型，旋渦振蕩器美國賽洛捷克公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化

將乳雙歧桿菌Z-1 接種到改良MRS 液體培養基中，按1%接種量進行活化，經2 次傳代，37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養12 h 獲得對數生長期的菌液。

1.2.2 單因素試驗優化培養基

將經活化2 代的菌體接種到2%不同碳源（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、1%不同氮源（蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨）、3%不同生長因子（胡蘿卜汁、麥芽汁、玉米漿） 的改良MRS 液體培養基中厭氧培養12 h，采用乳雙歧桿菌固體計數培養基按GB 4789.34—2016 方法進行活菌數測定。

1.2.3 Plackett-Burman 篩選設計

以1.2.2 優化的增菌培養基為基礎，通過Plackett-Burman 設計，從11 種培養基成分中篩選出對乳雙歧桿菌Z-1 菌數有顯著性影響的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗

為更好地建立響應面擬合方程，確定最佳響應值區域，采用最陡爬坡試驗近一步確定主要影響乳雙歧桿菌Z-1 菌數因素的最優濃度。該試驗以

1.2.3 中結果確定各顯著因素爬坡方向及步長。

1.2.5 BBD 響應面設計優化增菌培養基

響應面分析采用多元二次回歸方程擬合因素和響應值間的關系。通過對乳雙歧增菌培養基成分中的顯著性影響因素與菌體濃度之間的擬合，優化培養基中的關鍵成分，獲得優化培養基。

1.3 數據處理

采用Design-Expert8.0 軟件分析。

2 結果與分析

2.1 碳源的選擇

單因素試驗結果表明，分別按2%（乳糖和葡萄糖各1%） 添加不同碳源、按1%（蛋白胨和胰蛋白胨各0.5%） 添加不同氮源、按3%（麥芽濃縮汁和玉米漿各1.5%） 添加不同生長因子的增菌效果不同。其中乳糖作為碳源增菌效果最好，培養12 h 活菌數為1.9×109CFU/mL；胰蛋白胨為增菌效果最好的氮源，培養12 h 活菌數為1.53×109CFU/mL；玉米漿為增菌效果最好的生長因子，培養12 h 活菌數為1.84×109CFU/mL。因此選擇乳糖、胰蛋白胨和玉米漿為增菌培養基的碳源、氮源和生長因子，20 g/mL 乳糖、10 g/mL 胰蛋白胨和30 g/mL 麥芽汁為響應面試驗的因素低水平取值。

2.2 Plackett-Burman 試驗

根據單因素試驗結果，選取乳糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿共11 種組分進行N=20 的Plackett-Burman 試驗，確定對乳雙歧桿菌Z-1 菌量具有顯著影響的因素。

采用PB 試驗進行因素篩選，采取+1 水平是-1水平的2 倍進行設計。試驗設計和響應值及分析見表1、表2 和表3。

表1 PB 試驗設計的變量及不同水平的用量

表2 Plackett-Burman 試驗設計及結果

表3 PB 試驗顯著性分析表

由表3 可以看出，根據統計學分析，影響菌量的極顯著因素共有4 個，其中磷酸氫二鉀貢獻率為36.33，硫酸鎂貢獻率為10.27，L-半胱氨酸鹽酸鹽貢獻為19.70；玉米漿貢獻率為28.32。由此得出擬合回歸模型方程如下：

菌數Y=72.77-0.87A+1.13B-0.77C-0.27D+6.83E -0.27F+3.63G+0.37H -0.77J+5.03K +6.03L。

由方差分析表可知，模型有統計學意義（F=26.64，P＜0.05），調整R2為0.936 9，說明菌數的變化93.69%是由所選因素引起的。本模型中信噪比值為16.053，說明了模型的充分性和合理性。在所選因素中磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽、玉米漿對菌數的影響在0.01 水平有統計學意義，且為正向影響。

2.3 最陡爬坡試驗

根據PB 試驗，磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿均為正效應，故爬坡方向均向上。以磷酸二氫鉀方程系數為基準量分別確定各顯著因素濃度，具體見表4、表5。

表4 最陡爬坡試驗各因素步長水平表

表5 最陡爬坡試驗設計及結果

由表5 看出，因素水平在原點+4△處菌量達到最大，之后菌量減少，最大值出現的響應區間在因素水平4 附近，選擇因素水平4 作為中心點。

2.4 響應面試驗

以磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿為自變因素，采用響應面法對最佳培養基進行優化。

2.4.1 響應面試驗因素水平及結果

運用Box-Behnken 組合試驗設計原理，對磷酸氫二鉀（A）、硫酸鎂（B）、L-半胱氨酸鹽酸鹽（C） 和玉米漿（D） 進行四因素三水平響應面分析試驗。響應面試驗因素水平和結果分別見表6 和表7。

表6 響應面試驗因素水平表

表7 響應面試驗設計與結果

2.4.2 響應面試驗結果及方差分析

利用Design-Expert 軟件對試驗數據進行分析，得到二次多項回歸方程：Y（菌量）=105.99 +3.43A -1.90B +0.68C +1.84D -3.17AB -2.28AC -3.16AD+0.32BC+3.57BD -0.66CD -2.87A2-6.10B2-7.55C2-8.66D2。菌量響應面擬合回歸方程的方差分析結果見表8。

由表8 方差分析結果可知，模型F=23.56，P＜0.0001 差異極顯著，且失擬項p＞0.05，故說明該模型顯著。模型的R2=0.9593，說明擬合程度很好，且R2Adj=0.918 6，R2pre=0.782 7，方差相差很小，說明可信度高，可以用此模型來分析預測最優培養基。

對單因素來講，磷酸氫二鉀、硫酸鎂和玉米漿對菌量影響均顯著，L-半胱氨酸鹽酸鹽對菌量影響不顯著，各因素對菌量影響程度為A＞B＞D＞C。對于交互作用來說，磷酸氫二鉀和硫酸鎂、磷酸氫二鉀和L-半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸氫二鉀和玉米漿以及硫酸鎂和玉米漿交互作用對菌量的影響顯著（P＜0.05），硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽以及L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互作用對菌量的影響不顯著（P＞0.05），對于模型的二次項來說均顯著。

2.4.3 響應面結果及分析

不同因素兩兩交互作用對菌量的影響結果見圖1～圖6。

表8 菌量響應面擬合回歸方程的方差分析

圖1 磷酸氫二鉀和硫酸鎂交互作用對菌量的影響

圖2 磷酸氫二鉀和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對菌量的影響

圖3 磷酸氫二鉀和玉米漿交互作用對菌量的影響

圖4 硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對菌量的影響

圖5 硫酸鎂和玉米漿交互作用對菌量的影響

圖6 L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互作用對菌量的影響

由圖1 可知，磷酸氫二鉀和硫酸鎂交互作用對菌量影響的等高線圖為橢圓形，說明對菌量影響顯著。當硫酸鎂不變時，隨著磷酸氫二鉀的增加，菌量呈迅速上升趨勢；當磷酸氫二鉀不變時，隨著硫酸鎂增加，菌量呈先上升后下降的趨勢。當磷酸氫二鉀為3.3 g/L，硫酸鎂為1.0 g/L 左右時菌量達到最大值。

圖2 反映了磷酸氫二鉀和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對菌量的影響，等高線圖為橢圓形，說明對菌量影響顯著，當L-半胱氨酸鹽酸鹽不變，隨著磷酸氫二鉀的增加，菌量先迅速上升后變化平緩；當磷酸氫二鉀不變時，隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽增加，菌量呈先上升后下降的趨勢。當磷酸氫二鉀為3.3 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽為2.4 g/L 左右時菌量取得最大值。

從圖3 可以看出，磷酸氫二鉀和玉米漿間交互作用對菌量的影響與圖1 相似，菌量在磷酸氫二鉀為3.3 g/L，玉米漿為82.5 g/L 時取得最大值。

圖4 反映了硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對菌量的影響，對菌量影響的等高線圖近似圓形，說明此因素對結果影響不顯著。但當固定一個變量，菌量會隨著另一個變量的增大先上升后下降，但隨著因素值的改變，菌量變化不是很明顯。當硫酸鎂為1.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽為2.48 g/L時菌量最高。

由圖5 可知，硫酸鎂和玉米漿交互作用對菌量影響的等高線圖為橢圓形，說明影響顯著，隨著因素的增加，菌量上升，在硫酸鎂為1.0 g/L，玉米漿為82.5 g/L 左右達到最大值，然后菌量出現下降。

圖6 為L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互作用對菌量的影響，等高線圖為圓形，說明對菌量的影響不顯著，在L-半胱氨酸鹽酸鹽為2.48 g/L，玉米漿為83.0 g/L 取得最大值。

由圖1～圖6 可知，響應面圖均為開口向下的凸面，故響應值R 存在極大值，為進一步優化結果，根據Design-Expert 軟件得出在磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互影響下，菌量最優條件為：磷酸氫二鉀3.228 g/L，硫酸鎂0.972 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽2.451 g/L，玉米漿81.298 g/L，在此條件下模型預測的菌量107.329×108CFU/mL。在37 ℃條件下恒溫培養12 h，實際菌量為104.67×108CFU/mL，因此該模型可較好預測乳雙歧桿菌Z-1 的生長情況。

3 結論

乳雙歧桿菌作為最典型的具有益生功能的菌株，在益生菌產品市場中應用極其廣泛。對乳雙歧桿菌Z-1 發酵菌數影響最顯著的因素為磷酸氫二鉀和硫酸鎂。礦物質鹽具有促進細胞分裂的作用，Caterine 等指出鎂離子、鉀離子和鈣離子能促進乳酸桿菌的增殖，是乳酸菌增殖必需的生長因子。玉米漿富含多種氨基酸、多肽類和維生素，并且含有還原糖及鉀、鎂、鈣、磷等礦物元素。研究表明，維生素可以提高菌體代謝途徑中的磷酸果糖激酶活性，促進乳酸菌的生長代謝，還可以降低菌體在培養過程中的死亡率。此外，乳酸菌可直接利用氨基酸，而多肽類則由細胞內的肽酶水解成為游離氨基酸被菌體利用。Etoh 等發現多肽類可顯著促進雙歧桿菌的生長，與本試驗結果一致。L-半胱氨酸鹽酸鹽是乳雙歧桿菌生長最重要的氨基酸，但試驗結果顯示增菌效果相對不顯著，可能與培養基中L-半胱氨酸鹽酸鹽的含量有關。但在交互作用中，磷酸氫二鉀與硫酸鎂、磷酸氫二鉀與L-半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸氫二鉀與玉米漿、硫酸鎂和玉米漿增菌效果均得到加強，表明礦物質鹽對于高密度培養基至關重要，L-半胱氨酸鹽酸鹽與玉米漿交互作用對菌數不顯著，可能與培養基中兩者的添加量較多有關。

通過單因素試驗、PB 試驗、最陡爬坡試驗及響應面設計得出乳雙歧桿菌Z-1 最優培養基組成為：乳糖2%、胰蛋白胨1%、酵母膏0.5%、牛肉膏1%、磷酸氫二鉀0.322 8%、檸檬酸銨0.26%、硫酸鎂0.097 2%、硫酸錳0.005%、吐溫80 0.15%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.245 1%、玉米漿8.129 8%。