髓樣分化因子88對姜黃素誘導(dǎo)肝星狀細胞凋亡的影響分析

廣州市紅十字會醫(yī)院（510240）童巧勤

肝臟纖維化是肝臟自身對一系列慢性刺激作出的自我修復(fù)反應(yīng)，目前已知肝臟纖維化的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細胞的增殖與活化[1]。現(xiàn)有研究表明，姜黃素促進肝臟星狀細胞的凋亡從而起到抗肝纖維化的目的，其主要可能機制是姜黃素能夠抑制星狀細胞Ⅰ型膠原蛋白α1的表達以及其他一系列的信號通路的改變，其中較為重要的是髓樣分化因子88（MyD88）依賴性信號通路，而MyD88是該信號通路中的一項重要蛋白[2]。而MyD88是否在姜黃素抑制星狀細胞的凋亡過程中起到一定作用，目前尚未可知，本研究即探究MyD88對姜黃素抑制星狀細胞的凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 基本資料 本次研究所用到的主要試劑與材料有肝星狀細胞株HSC-T6、姜黃素、MyD88 siRNA、特級新生小牛血清、胰蛋白酶、MyD88抗體、一抗二抗剝脫液等。其來源統(tǒng)計如附表1。

1.2 方法 細胞培養(yǎng)：采用大鼠肝星狀細胞株HSC-T6，細胞株培養(yǎng)在含 100 U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。細胞培養(yǎng)箱條件為37℃，含有5%CO2。以下所有實驗用細胞均取對數(shù)生長期細胞。

細胞傳代：待培養(yǎng)瓶中的細胞生長至約90%融合時，進行細胞傳代。從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)液后，向瓶內(nèi)加入1ml消化液（0.25%胰蛋白酶）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，然后倒掉消化液，再加入1ml新的消化液，輕輕搖動后再倒掉大部分消化液，僅留少許進行消化。消化2～5分鐘后把培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立即加入含血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，使之成為單細胞懸液。將得到的細胞懸液分瓶培養(yǎng)。按照1∶2比例傳代。

MyD88及姜黃素處理：將培養(yǎng)的HSC-T6細胞分為對照組、MyD88組、姜黃素組、MyD88+姜黃素組，采用MyD88 siRNA對MyD88組、MyD88+姜黃素組進行干擾，48h后再加入姜黃素進行干擾24h。

1.3 指標(biāo)檢查方法 Western印跡檢測蛋白表達：采用胰酶消化離心生長至對數(shù)期的HSC-T6細胞細胞，并加入細胞裂解液，反復(fù)吹打細胞混液使裂解液充分作用，30min后對其進行離心取上清液，Bradford法對上清液進行蛋白定量處理，取上清液0.05ml與0.1mlSDS混勻后再加入4倍體積的PBS溶液，加熱至沸騰變性；將變性蛋白進行凝膠電泳處理后用5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜1h，加入已孵育好的一抗，過夜，洗膜，加入二抗后孵育120min，顯影，最后用Quantity One4.6.2軟件分析目的條帶的灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)的GAPDH條帶灰度值的比值，作為目的蛋白的相對量，用于統(tǒng)計學(xué)分析。將每小組3個樣本的對應(yīng)結(jié)果計算后，取平均值。

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：取相同量的細胞混懸液，離心5min（1200r/min）后棄上清液，向各組中分別加入200μl的PBS溶液并輕輕混勻，然后依次加入AnnexinV-FITC染液和碘化丙啶(PI)各2μl，混勻后于37攝氏度溫箱內(nèi)孵育15min，結(jié)束后加入200μl的PBS溶液上流式細胞儀進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0分析，計量資料采用t值檢驗，計數(shù)比較卡方x2檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

附表1 實驗材料及來源統(tǒng)計表

附表2 四組細胞的MyD88表達水平對比

附表3 四組細胞的凋亡率對比

2 結(jié)果

2.1 四組細胞之間的MyD88表達水平MyD88組灰度比值為（0.472±0.022），姜黃素組灰度比值為（0.585±0.037），M y D 8 8+姜黃素組灰度比值為（0.184±0.039）、對照組灰度比值為（0.968±0.085），四組之間的統(tǒng)計學(xué)比較見附表2。

2.2 四組細胞凋亡率比較 MyD88組凋亡率為（8.389±1.131），姜黃凋亡率為（27.185±6.032），MyD88+姜黃素組凋亡率為（40.286±10.029）、對照組灰度比值為（7.927±1.025），四組之間的統(tǒng)計學(xué)比較見附表3。

3 討論

肝星狀細胞是肝纖維化過程中的關(guān)鍵細胞，而姜黃素具有良好的抗肝纖維化作用，目前對其作用機制的認識尚處于理論階段，主要認為與以下幾點關(guān)系密切：①姜黃素能降低多種膠原（Ⅰ～Ⅳ型）的表達同時能促進這些膠原的降解；②姜黃素可以抑制TIMP-1的表達，該因子的主要作用是促肝纖維化細胞因子的表達；③姜黃素能促進肝星狀細胞的凋亡[3][4]。其中促進肝星狀細胞的凋亡是其發(fā)揮主要可能機制是姜黃素能夠抑制星狀細胞Ⅰ型膠原蛋白α1的表達以及其他一系列的信號通路的改變，Toll樣受體通路（TLR）占主要作用。目前主要認為TLR激活后能夠?qū)е翹F-κB活化，而在TLR活化NF-κB的過程中，最主要的作用物質(zhì)是MyD88。本研究即從此出發(fā)探究MyD88對姜黃素促進肝星狀細胞凋亡效果的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用MyD88 siRNA、姜黃素、MyD88+姜黃素對星狀細胞進行干擾后，細胞的MyD88表達水平均降低，同時MyD88 siRNA、姜黃素單獨應(yīng)用時均不如MyD88+姜黃素的抑制作用強；而在對星狀細胞凋亡的影響作用上，姜黃素組、MyD88+姜黃素組的細胞明顯凋亡（P<0.05），而MyD88組未出現(xiàn)明顯凋亡（P>0.05），姜黃素組、MyD88+姜黃素組比較，MyD88+姜黃素組的凋亡率更高（P<0.05）。

總之，在肝星狀細胞降低MyD88的表達有助于提高姜黃素對其凋亡的促進作用。