不同分離培養條件對松乳菇菌絲的影響研究

鄭旋 康超 楊玲

摘 ? 要：為探索松乳菇分離培養條件，通過不同部位組織分離法對不同培養基進行松乳菇分離培養，分析了松乳菇菌柄、菌肉、菌柄與菌肉交界處組織分離的菌絲萌發和污染情況，以及4種培養基對松乳菇菌絲生長的影響。結果表明，從松乳菇菌柄與菌肉交界處進行組織分離的菌絲萌發率大、污染率小、分離成功率高;松乳菇菌絲在酵母葡萄糖培養基上生長速率快、長勢好，在PDA中添加干松針浸出液有利于松乳菇菌絲的培養。

關鍵詞：松乳菇;菌絲培養;組織分離法;培養基

松乳菇（Lactarius deliciosus），隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）、蘑菇目（Agaricales）、紅菇科（Russulaceae）、乳菇屬（Lactarius），別名松樹菌、松菌、紫花菌、美味松乳菇，是一種外生菌根真菌，其味道鮮美，具有較高的營養價值和生態價值，是兼具食藥用價值的珍貴食用菌，深受國內外市場歡迎[1-2]。因松乳菇菌絲生長緩慢，需與宿主植物建立共生關系，且在適宜的生態條件下才能產生子實體，所以難以進行人工栽培[3]。目前，在新西蘭等國進行了松乳菇仿野生人工栽培并獲得成功[4-5]，但國內鮮見相關報道，且松乳菇菌種分離培養難度大，不同的分離培養條件對松乳菇菌絲生長有著較大的影響[6-8]。

本研究通過考察不同部位組織分離法和不同培養基對松乳菇菌絲培養的影響，為成功獲得松乳菇菌種及后續開展松乳菇仿人工栽培提供依據。

1 ? 材料與方法

松乳菇為采集自貴陽市高坡市場的野生松乳菇，子實體完整，無損傷。

1.1 ? 試劑

葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O為分析純（AR）;酵母粉為生化試劑（BR）;馬鈴薯、鮮松針、干松針等為市場購買。

1.2 ? 培養基

（1）馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH值自然;

（2）酵母葡萄糖培養基（JM）：酵母浸出粉5 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O為0.5 g，KH2PO4為1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然;

（3）鮮松針PDA培養基（SXZ）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，鮮松針浸出液（鮮松針200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然;

（4）干松針PDA培養基（SXG）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，干松針浸出液（干松針200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然。

1.3 ? 方法

1.3.1 ? 不同部位組織分離

挑選2個新鮮的野生松乳菇子實體，用軟刷去除表面雜質，再用75%酒精擦拭表面1～2次。在超凈工作臺上，用手將消毒處理過的松乳菇子實體從中間一分為二掰開，盡量不要觸碰到子實體內部，然后用經過滅菌處理的解剖刀分別從菌柄、菌柄與菌肉交界處、菌肉3個部位，切取2～3 mm大小的組織塊放入PDA平板培養基上，每個處理3個重復，于25 ℃恒溫培養箱內避光培養，記錄不同部位組織分離的菌絲萌發、污染等情況。

萌發率=萌發數量/分離總數×100%;污染率=污染數量/分離總數×100%;成功率=成功數量/分離總數×100%。

1.3.2 ? 菌種保存與活化

待菌絲萌發后，選取無污染、長勢好的菌絲再次轉入PDA培養基上培養，菌絲接近長滿平板表面時轉入PDA斜面試管中，于4 ℃溫度條件的冰箱內保存。將保存的松乳菇菌株接種到PDA平板培養基，活化10～20 d備用。

1.3.3 ? 不同培養基接種

分別將酵母葡萄糖培養基、鮮松針PDA培養基和干松針PDA培養基制作成平板（D=9 cm）培養基，挑取1塊活化的松乳菇菌塊（0.3 cm2）接種到培養基中央，馬鈴薯葡萄糖培養基作為對照組，每個處理5個重復，25 ℃恒溫避光培養35 d，觀察并測定松乳菇菌落形態、菌絲長勢、顏色、生長速率等。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 不同部位組織分離法對松乳菇分離的影響

采用組織分離法對松乳菇的不同部位進行分離試驗，結果如表1所示。由表1可見，松乳菇子實體不同部位組織分離的污染率由大至小分別為：菌柄>菌肉>菌柄與菌肉交界處;從萌發情況來看，菌柄與菌肉交界處萌發數量較多，自菌肉和菌柄部位分離的部位萌發率較低;分離成功率最高的為菌柄與菌肉交界處，成功率最低的為菌柄處。

2.2 ? 不同培養基對松乳菇菌絲培養的影響

2.2.1 ? 菌絲和菌落特征

由圖1可見，在不同的培養基上松乳菇的菌絲和菌落形態有較大差異。在SXG和PDA培養基上，菌落呈棕黃色，隨著培養時間延長，顏色不斷加深，部分有縱向鉤紋形成，菌絲粗壯，呈針尖狀，平匍或稍向空中延生生長;在SXZ培養基上，菌塊周圍有暗色色素沉淀的暈圈，菌落棕黃偏橘色，菌絲較細短，呈茸毛狀，部分產生溶解性菌液;在JM培養基上，菌落初期白色，后呈淡黃色，菌絲細密，匍匐貼壁生長。

2.2.2 ? 菌絲生長速度

由表2可以得知，隨著培養時間的增加，4種培養基上松乳菇菌絲開始萌發、生長，在20～25 d前菌絲生長較快、菌落直徑不斷增大;25～30 d后菌絲生長變緩慢、菌落直徑增幅變化不大。其中，菌絲在JM培養基上生長速度最快，菌落直徑最大，在第35天時菌落直徑達到最大值31.90 mm;其次是在SXG和PDA培養基上，第30天時菌落直徑分別達到8.41 mm和6.53 mm;而在SXZ培養基上，第25天時菌落直徑只有4.96 mm，之后菌絲停止生長。

3 ? 討論

通過比較不同部位組織分離法和不同培養基對松乳菇分離及菌絲培養產生的影響，結果表明，在進行松乳菇組織分離時，選取松乳菇菌柄和菌肉交界處的組織塊更有利于菌種分離成功;選擇以酵母浸出粉作為氮源的JM培養基有利于松乳菇菌絲快速生長;在PDA中添加干松針浸出液有利于菌絲形成;但在PDA中添加鮮松針浸出液則不利于菌絲生長，甚至會產生抑制作用。

參考文獻：

[ 1 ] 張光亞.中國食用菌圖鑒[M].昆明：云南科技出版社，1999.

[ 2 ] 敖常偉，惠明，李忠海，等.松乳菇營養成分分析及松乳菇多糖的提取分離[J].食品工業科技，2003，24（9）：77-79.

[ 3 ] 欒慶書，王琴，趙瑞興，等.外生菌根真菌研究法（第1版）[M].沈陽：遼寧科學技術出版社，2004.

[ 4 ] Alexis Guerin-Laguette，Nicholas Cummings，Ruth CatherineButler，et al.Lactarius deliciosus and Pinus radiata in NewZealand： towards the development of innovative gourmetmushroom orchards[J].Mycorrhiza，2014，24（7）： 511-523.

[ 5 ] Guerin-Laguette A，Plassard C，Mousain D.Effects of experi-mental conditions on mycorrhizal relationships betweenPinus sylvestris and Lactarius deliciosus and unprecedentedfruit-body formation of the Saffron milk cap under controlledconditions[J].Canandian Journal of Microbiology，2000，46（9）：790-799.

[ 6 ] 羅振敏.野生松乳菇菌絲在不同培養基上的分離試驗[J].現代農業科技，2010（3）：146.

[ 7 ] 羅曉蔓，周書宇，楊雪.植物根系分泌物的分類和作用[J].安徽農業科學，2019，47（4）：37-39.

[ 8 ] 劉軍，溫學森，郎愛東.植物根系分泌物成分及其作用的研究進展[J].食品與安全，2007，9（3A）：63-65.