HS-SPME arrow-GC/MS 結合化學計量學分析煙草香氣突變體中特征香氣成分

徐曉玲，曹建敏，龐雪莉，林櫻楠，曹鵬云，劉貫山，孔芳芳，王大海，王德勛，范志勇，邱 軍*

1. 中國農業科學院煙草研究所，山東省青島市嶗山區科苑經四路11 號 266101 2. 中國農業科學院研究生院，北京市海淀區中關村南大街12 號 100081 3. 山東濰坊煙草有限公司諸城分公司，山東省濰坊市諸城市密州路37 號 262200 4. 云南省煙草公司大理州公司，云南省大理市下關鎮鶴慶路71 號 671000

為創新煙草種質資源，培育優良品種，在煙草基因組計劃重大專項的支持下，研究人員采用化學誘變劑處理煙草種子，獲得一系列具有特征香韻的煙草高香氣突變體材料，經過多年田間鑒定及烤后煙葉感官質量評價，培育了多個具有穩定遺傳性狀的特征香韻突變品系［1-3］。薩姆遜香突變體材料是其中一種，它是由甲基磺酸乙酯（EMS）誘變烤煙品系中煙100 種子獲得的特征香韻材料，其田間長勢與中煙100 一致，但烤后煙葉感官質量具有明顯的香料煙特征香韻，且質量評價檔次較高。煙草高香氣突變品系香氣特征的表現與其釋放的香氣成分種類和含量之間存在直接聯系［4］。煙草揮發性香氣成分組成復雜、含量差異大，高效、靈敏的樣品提取方法對煙草特征香氣成分的分離分析結果有重要影響。SPME arrow 是一種基于固相微萃取（Solid-phase microextraction，SPME）技術的新裝置，近年來得到了日益廣泛的應用［5-6］，與常規SPME 相比，其填料量大、吸附性能好、使用壽命長，可顯著提高方法靈敏度和樣品萃取效率。SPME arrow 在揮發性物質檢測中具有樣品制備簡單，操作方便，測定快速高效，結果穩定性高等優勢，已逐漸應用于大氣、水和食品等樣品的分析［7-9］。目前，關于SPME arrow 在煙草揮發物領域的研究未見報道。因此，本研究中以SPME arrow 技術為基礎，以薩姆遜香突變體和中煙100 烤后煙葉為試驗材料，采用單因素試驗考察了萃取頭種類、平衡時間、萃取時間和萃取溫度對揮發性香氣成分萃取效果的影響，結合GC/MS 非靶標分析技術，建立煙草中揮發性香氣成分的檢測方法，同時結合PCA 和PLS-DA 等化學計量學手段，揭示薩姆遜香突變體材料的香氣物質基礎，明確薩姆遜香突變體與對照中煙100 中香氣成分的差異，旨在為不同香氣風格煙草揮發性香氣成分的分析與數據挖掘提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

試驗材料為2018 年山東省諸城市洛莊試驗站種植的特征香韻突變體（薩姆遜香）和對照中煙100（ZY100）的烤后煙葉，等級為C3F，由中國農業科學院煙草研究所生物技術研究中心提供。

α-紫羅蘭酮（99%，湖北鴻運隆生物科技有限公司）。

7890A/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；ZZ-SPME-t 固相微萃取加熱臺（青島貞正分析儀器有限公司）；FA2004 電子天平（感量0.000 1 g，上海精密科學儀器有限公司）；箭型固相微萃取進樣器及4 種SPME arrow 萃取頭，包括PDMS（100 μm×20 mm）、CAR/PDMS（120 μm×20 mm）、DVB/PDMS（120 μm×20 mm）、DVB/CAR/PDMS（120 μm×20 mm）（瑞士CTC 分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理及GC/MS 分析

烤后煙葉樣品去除主脈后，剪成細片狀，置于烘箱中40 ℃下烘干，磨成煙末，過0.425 mm（40目）篩。準確稱取煙末1.0 g，置于20 mL 頂空瓶（配有聚四氟乙烯墊密封蓋）中，用微量注射器將α-紫羅蘭酮（內標，質量濃度110μg/mL）滴在頂空瓶內側，密封后置于固相微萃取加熱臺上平衡；將老化后的萃取頭插入頂空瓶中，頂空采樣一定時間；從頂空瓶中拔出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口，在250 ℃下解吸10 min，進行GC/MS 檢測。GC/MS 條件為：

色譜柱：HP-FFAP 石英毛細管（50 m×0.32 mm×0.50 μm）；載氣：高純氦氣，流速1.5 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：不分流進樣；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，先以10 ℃/min升至130 ℃，再以3 ℃/min 升至200 ℃，最后以5 ℃/min 升至230 ℃，保持20 min；離子源：EI 源；電離電壓：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；掃描方式：全掃描；掃描范圍：33～600 amu。

1.2.2 數據處理

在提取條件優化數據分析中，對揮發性物質的色譜峰進行自動積分，得到不同條件下煙草揮發性物質的色譜峰數量和總峰面積。為確保方法的可靠性，SPME arrow 提取條件優化部分涉及的色譜峰數量均為化合物峰面積在平行樣品間相對標準偏差（RSD）＜30%的有效色譜峰。

經過預實驗確認，選擇試驗樣品中不存在且可與其他各組分完全分離的α-紫羅蘭酮為內標，采用相對峰面積（各組分峰面積與內標峰面積比值）進行分析。本研究中設置了質控（QC）樣品，該樣品由試驗樣品等量混合而成，用于監控整個試驗過程。用SIMCA-P13.0 軟件篩選出薩姆遜香突變體和對照中煙100 間的差異物質。為消除成分間因含量差異較大而對樣本造成的影響，在數據導入前對原始數據進行了標準化處理。對于差異物質的色譜峰，利用美國國家標準與技術局化學數據庫（https：//webbook.nist.gov/chemistry/）的標準離子片段進行檢索，結合輔助保留指數（Retention index，RI）對比和文獻比對等人工解析方式，對差異物質進行鑒定。

2 結果與討論

2.1 SPME arrow 萃取條件的優化

2.1.1 萃取頭種類的選擇

煙草中的揮發性物質成分較為復雜，通常包括酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、酚類物質等，因此極性和非極性萃取頭相結合更適合于此類復雜物質的萃取。在基于常規SPME 方法的煙草揮發性物質檢測中，CAR/PDMS 和DVB/CAR/PDMS 萃取頭較常用。向章敏等［10］選擇PDMS/DVB/CAR 萃取頭進行了煙草揮發性生物堿分析。楊瓊等［11］選擇CAR/PDMS 萃取頭對煙氣中揮發性和半揮發性成分進行了測定。Tae 等［12］采用SPME arrow 進行糙米醋中揮發物分析時，發現CAR/PDMS 的萃取效果優于其他幾種萃取頭。

本 研 究 中 選 擇PDMS、DVB/PDMS、CAR/PDMS 和DVB/CAR/PDMS 4 種萃取頭進行測試，比較了不同材質萃取頭對烤后煙葉揮發性香氣成分選擇性和重現性的影響。從圖1 可以看出，不同吸附涂層的纖維頭對煙葉揮發性香氣成分的分析結果影響較大，4 種萃取頭中CAR/PDMS 萃取頭的色譜峰數量和總峰面積都明顯高于其他3 種萃取頭。可見，CAR/PDMS 在煙草揮發性物質檢測中萃取物質種類多，靈敏度高。因此，選擇CAR/PDMS 為吸附萃取頭。

圖1 4 種SPME arrow 的萃取效果比較Fig.1 Comparison of extraction effects among four SPME arrows

2.1.2 平衡時間的確定

平衡時間不僅可以決定揮發性成分和樣品之間的兩相平衡效果，還影響萃取頭的吸附量和達到吸附平衡的時間［13］。為進一步優化SPME arrow的平衡時間，選擇萃取效果較好的CAR/PDMS 作為吸附萃取頭，固定萃取時間為30 min，萃取溫度為70 ℃，考察了平衡時間（10、20、30、40、50、60、70 min）對萃取效果的影響。結果（圖2）顯示，當平衡時間達到40 min 時，色譜峰數量和總峰面積趨于穩定，再延長平衡時間二者變化不大，因此確定平衡時間40 min。

圖2 不同平衡時間的萃取效果比較Fig.2 Comparison of extraction effects at different equilibrium times

2.1.3 萃取時間的確定

為進一步優化SPME arrow 的萃取時間，固定CAR/PDMS 為吸附萃取頭，平衡時間為40 min，萃取溫度為70 ℃，考察了萃取時間（10、20、30、40、50、60、70 min）對萃取效果的影響。由圖3 可知，隨著萃取時間的延長，色譜峰數量和總峰面積也隨之增大，在40 min 后趨于平緩，說明物質吸附和脫附之間達到平衡。當萃取時間為70 min 時，總峰面積略有下降，這可能是因為萃取頭涂層吸附已經趨于飽和，萃取時間過長會導致熱穩定性差的物質分解或者少量易揮發性組分逸出，進而造成物質損失，使總峰面積減小。因此，確定萃取時間為40 min。

圖3 不同萃取時間的萃取效果比較Fig.3 Comparison of extraction effects at different extraction time

2.1.4 萃取溫度的選擇

萃取溫度的高低直接影響目標物的吸附效果［14］。溫度過低會使平衡時間變長，萃取的揮發性成分的數量和種類也較少。當溫度升高時，揮發出來的物質種類和數量增加，但是溫度過高時，一方面，會導致平衡蒸汽壓增大，分子熱運動加快，吸附平衡系數降低，物質吸附量減少［15］，另一方面，會使萃取頭上熱穩定性差的物質發生解析，吸附量減少。Feng 等［16］研究表明，低分子量的揮發性物質，包括乙醇和乙酸乙酯，由于分配系數較低，在較高溫度下峰面積較小。另外，當溫度超過100 ℃時，煙末中的糖類物質和氨基酸之間會發生美拉德反應，生成其他產物［17］，影響定性分析結果。因此，在煙草揮發性物質分析中，萃取溫度一般都不超過100 ℃。

為進一步優化SPME arrow 的萃取溫度，固定CAR/PDMS 為吸附萃取頭，平衡時間為40 min，萃取時間為40 min，考察了萃取溫度（40、50、60、70、80、90、100 ℃）對萃取效果的影響。結果（圖4）顯示，隨著溫度的升高，總峰面積不斷增加，但有效色譜峰數量呈現先上升再下降的趨勢，在溫度升至70 ℃后不斷降低，說明溫度超過70 ℃后，揮發性物質不穩定，樣品間重現性變差。綜合考慮，選擇萃取溫度為70 ℃。

2.2 方法學評價

HS-SPME arrow-GC/MS 測定和多元統計分析中，重現性為方法穩定性的主要考察指標之一。連續6 d，采用優化的方法檢測QC 樣品，對方法的重現性進行考察。從QC 樣品中共檢測到178個色譜峰。所有色譜峰保留時間的相對偏差均在±0.03 min 內，說明保留時間穩定，有利于自動積分。在178 個色譜峰中，峰面積RSD＜10%、10%～20%、20%～30%的色譜峰個數分別為74、62 和23個。159 種化合物色譜峰相對峰面積的RSD＜30%，占色譜峰總數量的89.3%。

圖4 不同萃取溫度的萃取效果比較Fig.4 Comparison of extraction effects at different extraction temperatures

2.3 煙草香氣突變體特征香氣成分解析

2.3.1 香氣成分PCA 分析

將數據導入SIMCA-P13.0 軟件，變量經Par-scaling 標度化處理后，采用非監督模式識別方法（PCA）觀察各樣本的總體分布情況。PCA 可以盡可能多地反映變量的原始信息，直觀顯示不同樣本之間的整體差異，從得分圖（圖5）可以看出，QC 樣本緊密聚集，說明試驗過程中，檢測方法和儀器狀態穩定，對結果影響較小。薩姆遜香突變體與中煙100 可以自然聚集為兩類，說明兩個樣品間香氣物質存在一定差異。

圖5 香氣成分PCA 得分圖Fig.5 PCA score plot of aroma components

2.3.2 香氣成分PLS-DA 分析及特征香氣成分解析

為進一步研究薩姆遜香煙草突變體與對照中煙100 之間香氣成分的差異，采用有監督的模式識別方法最小二乘判別分析（PLS-DA），對兩個材料煙葉的揮發性香氣成分進行分析，分析結果見圖6。由圖6 可以看出，兩組樣品聚類良好，可顯著分離。結合評價PLS-DA 模型質量的3 個關鍵指標可知，R2X=0.691，R2Y=0.991，Q2=0.966，說明模型的穩定性和預測性較好。此外，為了驗證模型是否存在過擬合現象，本研究中還對模型進行了200次響應排序（圖7）。排列實驗中左端任何一次隨機排列產生的R2、Q2值均小于右端的原始值，Q2截距值等于或小于0，則表明模型有效。由圖7 可知，R2和Q2的截距分別為0.614 和-0.146，說明模型有效，不存在過擬合現象。

圖6 香氣成分PLS-DA 得分圖Fig.6 PLS-DA score plot of aroma components

圖7 PLS-DA 模型200 次交叉檢驗驗證圖Fig.7 Cross-validation plot of PLS-DA with 200 permutation tests

表1 薩姆遜香突變體和中煙100 的差異揮發性成分Tab.1 Differential volatile compounds between Samson and ZY100

采用變量權重重要性排序（Variable Importance in Projection，VIP），結合T-檢驗的P值（閾值為0.05），對PLS-DA 模型中差異性較大的代謝物進行篩選。以VIP＞1.0 為標準，篩選了對模型分類貢獻較大的33 個變量（表1）。VIP 值越大，說明香氣成分在兩個樣本間的差異越顯著。差異倍數（fold change，FC）為香氣成分在薩姆遜香突變體和中煙100 中相對含量的比值，P值由T-檢驗獲得。由表1 可知，33 種差異代謝物中包含酮類10種，酸類7 種，醇類4 種，醛類3 種，酯類2 種，其他類別化合物7 種。其中，薩姆遜香材料中絕大部分物質的含量高于中煙100，中煙100 中僅有4 種化合物（乙酸、苯甲醛、十六酸甲酯、二烯煙堿）的含量高于薩姆遜香突變體。

薩姆遜香突變體具有明顯的香料煙特征香韻，煙葉具有濃郁芳香、吃味醇和等特點。研究表明，香料煙的揮發性有機酸對煙葉的香氣貢獻較大［18］，香料煙中β-甲基戊酸、戊酸和異戊酸的含量比烤煙中高，其香氣強度明顯高于其他揮發性有機酸，而甲酸和乙酸的含量則相對較低［19］。本研究中篩選出7 種差異顯著的有機酸，其中，乙酸含量降低，而β-甲基戊酸、戊酸、己酸等6 種有機酸的含量均升高，這與香料煙的特性相符合。在酮類揮發性香氣成分中，茄酮、降茄二酮、β-二氫大馬酮和β-大馬酮等重要香氣物質的含量顯著升高。茄酮及其降解產物降茄二酮是煙草重要的香味物質，其香氣與煙香協調，可賦予煙氣類似胡蘿卜的香味以及甘草香和茶香，在提高卷煙香氣質、香氣量等方面發揮著重要作用［20］。薩姆遜香材料中β-大馬酮含量是中煙100 的4.78 倍，β-大馬酮是類胡蘿卜素的主要降解產物，屬于中性致香物質［21］。苯甲醛和糠醛是煙草中兩種重要的醛類香氣物質，二者分別屬于苯丙氨酸類代謝產物和棕色化反應產物，與中煙100 相比，薩姆遜香突變體中苯甲醛含量極顯著降低，而糠醛含量極顯著增加，這與常愛霞等［21］對烤煙和香料煙中揮發性致香物質的研究結果一致。此外，與對照中煙100 相比，薩姆遜香突變體中4 種醇類物質（5-甲基-2-呋喃甲醇、8-羥基芳樟醇、苯甲醇和環己醇）的含量均極顯著增加。可見，薩姆遜香突變體煙葉中香氣物質的組成、含量及各組分之間的平衡協調性綜合影響了煙葉的香氣特征。

表1（續）

3 結論

通過對影響SPME arrow 萃取效率的4 個主要因素（萃取頭涂層種類、平衡時間、萃取時間和萃取溫度）進行優化，建立了一種基于HS-SPME arrow-GC/MS 測定煙草揮發性香氣成分的方法。本方法具有簡單、可靠，靈敏度高，重現性較好等特點，可用于批量樣品的檢測與分析，尤其適合于低分子量揮發性香氣成分的分析。將本方法與化學計量學相結合，分析了薩姆遜香突變體和中煙100 煙葉中香氣成分的差異，從兩個材料中鑒定出包括酮類、酸類、醇類、醛類、酯類物質等33 種差異香氣組分。兩種不同香氣特征的煙葉在模型中實現了顯著分離，香氣成分差異顯著。