海南植煙區煙田煙粉虱隱種分布和系統發育分析

李 萌，夏長劍，邵 雨，薛國喜，賀 遠，王天玉，呂洪坤，陳德鑫*

1. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道136 號 450001 2. 中國煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所，海口市紅城湖路22 號 571100 3. 海南省煙草公司儋州市公司，海南省儋州市那大鎮中興街中段 571700

煙粉虱（Bemisia tabaci）是我國煙草上的重要害蟲，主要以刺吸植物汁液、分泌蜜露誘發煤污病及傳播煙草曲葉病毒病（Tobacco leaf curl disease，TLCD）3 種方式為害煙草，尤其以傳播曲葉病毒病造成的損失最為嚴重［1-4］。煙粉虱的分類地位一直存在爭議，目前普遍認為煙粉虱在形態上很難區分，但在抗藥性、寄主適應性及傳毒效率等生物學特性上存在明顯差異，是多個隱種構成的復合種［5］。臧連生等［6］研究發現入侵的煙粉虱隱種MEAM1 對吡蟲啉和吡丙醚的敏感性均低于土著煙粉虱隱種Asia II 3。Jiu 等［7］比較了入侵和土著煙粉虱在煙草（品種為NC89）上的生殖力和壽命，發現入侵煙粉虱隱種MEAM1 在煙草上的壽命和產卵量均顯著高于土著煙粉虱隱種Asia II 3。Liu等［8］發現入侵煙粉虱隱種MEAM1 可高效傳播煙草曲葉病毒病病原中國番茄黃化曲葉病毒，而入侵煙粉虱隱種MED 卻不能傳播該病毒。由于不同煙粉虱隱種在重要生物學特性上差異顯著，煙粉虱隱種類型的準確鑒定已成為制定有效防治技術的基本前提。盡管已有許多研究報道了煙粉虱對煙草的為害［9-12］，但對煙田煙粉虱隱種進行鑒定的報道卻不多。饒瓊等［13］報道湖北武漢煙草上發生的煙粉虱隱種為MEAM1；趙瑞華等［14］報道陜西延安煙草上發生的煙粉虱隱種為MEAM1 和MED；Jiu 等［15］報道河南許昌煙草上發生的煙粉虱隱種為MED。海南是我國雪茄煙葉的主要產區和重要的煙草南繁育種基地，由于以往煙草栽培面積有限，海南煙草病蟲害的普查工作較為滯后，海南煙草上煙粉虱危害狀況的研究尚鮮見報道，其隱種類型也不清楚。因此，為明確海南煙草上煙粉虱的發生狀況和隱種分布，調查了海南省主要植煙區煙田煙粉虱及其傳播曲葉病毒病的發生程度，并應用線粒體COI基因PCR-RFLP 和系統發育分析對煙粉虱隱種類型進行了鑒定，旨在為了解海南煙草上煙粉虱隱種多樣性及對煙粉虱進行綜合治理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料從海南省儋州、屯昌和澄邁的雪茄煙田及三亞、樂東煙草南繁育種基地采集的煙粉虱樣品。

1.1.2 試劑

2×Taq Plus Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA 聚合酶、Taq I 內切酶、蛋白酶K、帕拉膜和瓊脂糖等購自生工生物工程（上海）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.3 儀器

Vetiti 型 梯 度PCR 儀（美 國ABI 公 司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Mini Bis Pro 型凝膠成像分析系統（以色列DNR 凝膠成像系統有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 田間調查和樣品采集

在每塊煙田以“Z”字形選取5 個調查點（每點50 株），于2019 年2～4 月調查整株煙草上的煙粉虱成蟲數量和煙草曲葉病毒病發病株數，計算發病率。調查過程中用裝有無水乙醇的1.5 mL 離心管隨機采集活體煙粉虱成蟲30～50 頭。采集的煙粉虱樣品于-20 ℃保存。

1.2.2 煙粉虱基因組DNA 提取

用移液器把單頭煙粉虱從無水乙醇中吸至剪成小片的帕拉膜上，待酒精揮發后滴加15μL 裂解液（10 mmol/L Tris，pH 8.4；50 mmol/L KCl，0.45%Tween-20，0.2%Gelatin，0.45%NP40，100μg/mL 蛋白酶K），用0.2 mL 離心管底部充分研磨蟲體，將勻漿液吸入0.2 mL 離心管中。吸取10μL 裂解液清洗帕拉膜上的研磨煙粉虱處數次，將清洗液與勻漿液合并。將含煙粉虱提取液的0.2 mL 離心管置入PCR 儀中65 ℃孵育30 min，然后95 ℃10 min滅活蛋白酶K 即完成煙粉虱基因組DNA 提取。提取的煙粉虱基因組DNA 于-20 ℃儲存。

1.2.3 線粒體COI基因PCR-RFLP 鑒定

每個采樣點隨機挑選30 頭煙粉虱，參考秦麗等［16］描述的線粒體COI基因PCR-RFLP 技術鑒定煙粉虱隱種。以煙粉虱基因組DNA 為模板，應用通用引物C1-J-2195（5'-TTGATTTTTTGGTCATCC AGAAGT-3'）和TL2-N-3014（5'-TCCAATGCACTA ATCTGCCAT ATTA-3'）擴增煙粉虱線粒體COI基因片段（866 bp）。PCR 反應體系（20μL）為：煙粉虱基因組DNA 2μL，2×Taq Plus Master Mix 10μL，10μmol/L 上下游引物各0.5μL，ddH2O 7μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1.5 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環，最后72 ℃延伸10 min。取PCR 產物進行酶切，酶切反應體系（10 μL）為：10×Buffer 1 μL，Taq I內切酶（10 U）1 μL，PCR產物7 μL，ddH2O 1 μL，酶切反應條件為65 ℃1 h。酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳（85 V，40 min）后在凝膠成像系統上拍照，參照煙粉虱隱種標準圖譜鑒定煙粉虱隱種［16］。

1.2.4 線粒體COI基因測序與序列分析

線粒體COI基因通過PCR-RFLP 隱種鑒定，結果見圖1。每個采集點選擇2～3 個具有代表性線粒體COI基因PCR-RFLP 譜帶的樣本，應用1.2.3 節描述方法再次擴增其線粒體COI基因片段。PCR擴增產物送尚亞生物技術有限公司測序，測序結果保存于Genbank（表1）中。應用MEGA 6.0 的鄰接法構建系統發育樹，并分析海南煙草上煙粉虱隱種和中國境內已知的14 種煙粉虱隱種線粒體COI基因的遺傳距離和親緣關系。

圖1 海南澄邁煙粉虱線粒體COI 基因PCR 產物Taq I 酶切圖譜Fig.1 PCR products of mitochondrial COI of Bemisia tabaci in Chengmai，Hainan after digested by Taq I

2 結果與分析

2.1 煙粉虱及其傳播的煙草曲葉病毒病的發生概況

在儋州、屯昌、五指山和澄邁4 個雪茄煙調查點及三亞、樂東2 個烤煙繁種調查點調查了煙粉虱及其傳播的曲葉病毒病發生和為害狀況，調查結果（表2）顯示，除五指山調查點外，其他調查煙田均發現煙粉虱為害，為害部位主要集中在中下部葉片。澄邁煙粉虱蟲株率較低（35%），其蟲口密度也最低（0.5 頭/株）；儋州、屯昌、三亞和樂東煙粉虱蟲株率均大于80%，蟲口密度為5～10 頭/株。除五指山外，所有發現煙粉虱的煙田均發現了感染煙草曲葉病毒的煙株，病株率為1%～3%，發病植株嚴重矮化、葉片扭曲，基本喪失經濟價值。

表1 序列分析所用線粒體COI 基因序列Tab.1 Mitochondrial COI gene sequences used for sequence analysis

表2 煙粉虱及其傳播曲葉病毒病田間調查結果Tab.2 Occurrences of Bemisia tabaci and tobacco leaf curl disease spread by B. tabaci in tobacco fields

2.2 線粒體COI 基因PCR-RFLP 鑒定煙粉虱隱種

5 個采集點共計150 頭煙粉虱的線粒體COI基因的TaqⅠ酶切圖譜呈現兩種類型（圖1），與秦麗等［16］報道的煙粉虱MEAM1 隱種和MED 隱種的線粒體COI基因PCR-RFLP 圖譜一致，初步表明海南煙草上發生的煙粉虱是入侵煙粉虱MEAM1 隱種和MED 隱種。

2.3 系統發育分析

應用海南12 個煙粉虱和中國境內已報道煙粉虱隱種線粒體COI基因序列構建的系統發育樹顯示，海南煙田煙粉虱形成了兩個分支，分別與入侵煙粉虱隱種MEAM1 隱種和MED 隱種聚為一支，表明海南煙田發生的煙粉虱為MEAM1 隱種和MED 隱種（圖2）。多重序列比對發現，海南MEAM1 隱種和MED 隱種的序列相似度為94%，不同地區MEAM1 隱種間的序列相似度為100%，不同地區MED 隱種間的序列相似度均大于99%，見表3。

圖2 基于線粒體COI 基因構建的煙粉虱隱種系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Bemisia tabaci cryptic species generated by analysis of mitochondrial COI sequences

表3 海南植煙區煙田煙粉虱隱種線粒體COI 基因序列相似度分析Tab.3 Similarity between mitochondrial COI sequences of Bemisia tabaci collected from different tobacco-growing areas in Hainan （%）

2.4 海南植煙區煙田煙粉虱種群分布

不同采集點煙粉虱隱種鑒定結果如表4 所示。海南儋州、屯昌和樂東煙田煙粉虱種群為MEAM1隱種；澄邁和三亞煙田為MEAM1 和MED 混合發生，MEAM1 所占比例分別為56.7%和83.3%。總體來看，海南煙草上發生的煙粉虱是入侵隱種MEAM1和MED，其中MEAM1為優勢隱種。

表4 海南植煙區煙粉虱隱種構成Tab.4 Cryptic species composition of Bemsia tabacci in different tobacco-growing areas in Hainan

3 討論

煙粉虱MEAM1 和MED 隱種是世界性重要入侵有害生物，主要為害葫蘆科、茄科和十字花科蔬果及花卉、棉花、煙草等經濟價值較高的作物［17］。海南早在2002 年就有MEAM1 隱種發生為害的報道［18］。海南已報道的煙粉虱隱種包括入侵隱種MEAM1 和MED 及Asia I 、Asia II 1 和China 1 3 個土著隱種［19］。與郭磊等［20］2017 年對海南三亞、澄邁和陵水茄科蔬菜和瓜類上煙粉虱的隱種鑒定結果類似，本研究中發現海南主要植煙區煙草上的煙粉虱為入侵隱種MEAM1 和MED，未發現土著煙粉虱，表明海南省田間發生為害的煙粉虱均為入侵煙粉虱隱種，土著煙粉虱隱種可能已被入侵煙粉虱隱種所取代。海南不同植煙區煙粉虱的隱種構成存在一定差異，儋州、屯昌和樂東煙田煙粉虱種群為MEAM1 隱種，而澄邁和三亞煙田則為MEAM1 和MED 混合發生。由于海南植煙歷史較短且多與蔬果產區重疊，推測這些差異可能與煙田周邊其他作物上的遷入蟲源的隱種構成有關。綜合來看，海南主要植煙區煙草上的煙粉虱的優勢隱種為MEAM1，有取代MED 隱種成為唯一隱種的趨勢。

本研究中還發現煙粉虱在海南植煙區煙草上發生普遍，但蟲口密度相對較低，并未對煙株生長發育造成可見為害，整體為害程度較輕。入侵煙粉虱隱種MEAM1 和MED 的寄主范圍很廣，但其對不同寄主或同一寄主植物的不同品種的適應性存在明顯差異［12，21］。田間調查發現，煙粉虱在雪茄煙煙株上的偽蛹和若蟲數量均較少，表明栽培的雪茄煙品種可能對煙粉虱的適合性不高。此外，本研究中調查的煙田周邊均距蔬菜田較遠或有林木隔離，致使蟲源遷入較少，這也可能是煙草上蟲口密度較低的原因。盡管煙粉虱造成的直接為害并不嚴重，但有煙粉虱分布的煙田均發現了煙草曲葉病毒病病株，個別地塊病株率高達5%，發病煙株基本失去經濟價值。由于煙粉虱對煙草曲葉病毒病病原的傳播效率較高且可終身攜毒［22］，因此，煙葉生產上仍需重視對媒介昆蟲煙粉虱的防治。

4 結論

對海南植煙區煙粉虱發生情況進行調查發現，煙粉虱在海南植煙區普遍發生，整體為害程度較輕，但其傳播的煙草曲葉病毒病在部分植煙區發生較為嚴重。應用線粒體COI基因PCR-RFLP和系統發育分析對不同植煙區煙田煙粉虱隱種進行了鑒定，結果顯示海南煙草上發生的煙粉虱是入侵隱種MEAM1 和MED，其中MEAM1 為優勢隱種。