煙草4 種病毒的多重RT-PCR 檢測(cè)方法構(gòu)建

楊 洋，汪 蝶，楊懿德，李林秋，鄢 敏，楊 輝*

1. 四川省煙草公司宜賓市公司，四川省宜賓市敘州區(qū)酒都路中段51 號(hào) 644002 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都市溫江區(qū)惠民路211 號(hào) 611130

煙草病毒病是目前煙草生產(chǎn)上分布廣泛且發(fā)生十分普遍的一大類病害。由于田間煙草病毒復(fù)合侵染普遍，各病毒間具有協(xié)同或拮抗作用，且各病毒在植株中的豐度有差異等，病毒病的癥狀具有復(fù)雜性和多樣性，難以僅依賴癥狀進(jìn)行判斷。相比電子顯微鏡觀察病毒粒子形態(tài)和生物學(xué)鑒定等方法，PCR 技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)［1-2］。多重PCR 檢測(cè)則是在單一PCR 只能檢測(cè)一種病毒的基礎(chǔ)上，通過在體系中加入多種不同的特異性引物，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，從而同時(shí)獲得多個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病毒病同時(shí)檢測(cè)的技術(shù)，適用于目前煙草病毒田間復(fù)合侵染的情況。

在煙草病毒的種類調(diào)查中，20 世紀(jì)80 年代中期，在云南煙區(qū)發(fā)現(xiàn)煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）呈現(xiàn)與煙草普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）混合侵染煙草的現(xiàn)象［3］。佟愛仔等［4］檢測(cè)發(fā)現(xiàn)云南煙田中煙草蝕紋病毒和煙草脈帶花葉病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）復(fù)合侵染煙草。李金嶺等［5］和王秀敏等［6］對(duì)陜西煙區(qū)煙草病毒病種類進(jìn)行檢測(cè)并鑒定出危害煙草的病毒，其中以煙草普通花葉病毒、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）復(fù)合侵染的檢出率最高。鑒于各煙區(qū)存在多種病毒，為實(shí)現(xiàn)對(duì)煙草病毒的快速檢測(cè)，已有報(bào)道建立了TMV 和CMV，以及TMV、CMV 和PVY 等病毒的多重PCR 檢測(cè)方法［8-10］。佟愛仔等［11］進(jìn)行了云南煙草蝕紋病毒與其他病毒復(fù)合侵染的多重RT-PCR 檢測(cè)。鄭軒等［12］利用TVBMV 與TMV、TEV、CMV、PVY 的外殼蛋白（Coat protein，CP）基因序列，建立了多重PCR 檢測(cè)方法。然而，根據(jù)鄭軒等［12］提供的方法，在人工接種的復(fù)合病毒檢測(cè)中，TVBMV 的檢出率低于TMV 和CMV。考慮到復(fù)合侵染的病毒間具有協(xié)同或拮抗作用，為探究TVBMV 相對(duì)低的檢出率是否由于在復(fù)合侵染中受到其他病毒的拮抗影響，分析TVBMV 與TMV、CMV 和PVY 的相互作用，并通過TVBMV 各基因的篩選，選取表達(dá)水平相對(duì)較高的基因優(yōu)化引物，調(diào)整引物和cDNA 的模板濃度，旨在建立一種高效、穩(wěn)定的多重PCR 檢測(cè)體系，以滿足各煙區(qū)對(duì)煙草病毒病檢測(cè)的需求。

1 材料與方法

1.1 病葉材料

感染TMV、CMV、PVY 和TVBMV 病毒的煙葉材料由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系提供，包括單獨(dú)接種TMV、CMV、PVY 和TVBMV 第7 天的煙葉及復(fù)合接種TMV、CMV、PVY 和TVBMV 第3 天和第7 天的煙葉。

1.2 試劑

Moloney Murine Leukemia Virus 逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV Reverse Transcriptase）、RNA 酶抑制劑、dNTP 和DL2000 Marker 均購自寶生物工程（大連）有限公司，Taq DNA Mix 聚合酶購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 煙草病葉總RNA 的提取

取煙草病葉0.1～0.3 g 于離心管中，加入液氮研磨成粉末狀，分別加入400 μL 的RNA 提取緩沖液及400 μL 酚/氯仿/異戊醇（體積比為25 ∶24 ∶1），充分混勻；12 000 g離心10 min，吸取上清液并加入其兩倍體積的4 mol/L LiCl，混合均勻后在-20 ℃下靜置沉淀20 min 以上；12 000 g 離心10 min，棄上清液；將沉淀用75%乙醇漂洗，12 000 g離心5 min，棄上清液，于室溫下充分干燥沉淀；用去離子水約30 μL 將沉淀溶解后置于-20 ℃冰箱保存，備用［13］。

1.4 反轉(zhuǎn)錄

取上述提取的總RNA500 ng，加入濃度為100 μmol/L 的下游引物1.0 μL，于70 ℃水浴5 min，迅速置于冰上；再加入2.5 μL 5×RT buffer，2 mmol/L的dNTP 0.5 μ L，2.5 U RNA 酶 抑 制 劑，2.5 U Reverse Transcriptase（M-MLV），無 菌 水 補(bǔ) 足 至10.0 μL；40 ℃水浴1 h；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加ddH2O 稀釋至30.0 μL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 引物設(shè)計(jì)

使用DNAMAN 6.0 軟件比對(duì)GenBank 中多條TMV、CMV 和PVY 外殼蛋白序列，以及TVBMV的全基因組序列，選擇序列保守區(qū)域。使用Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)要求目的片段的長度盡量在200～800 bp，長度不宜太接近，以免難以通過瓊脂糖電泳進(jìn)行區(qū)分。所得引物通過BLAST比對(duì)確保引物特異性良好。引物序列見表1。

1.6 單重PCR

采用25 μL 的PCR 反應(yīng)體系：2×Taq DNA Mix 12.5 μL；TMV、CMV、PVY 和TVBMV 的cDNA 均為1.0 μL；TMV、CMV、PVY 和TVBMV 的引物濃度均為20 μmol/L，上下游引物加入量分別為各0.5、0.5、1.0 和1.0 μL；用ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min；53.5 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。

1.7 多重PCR

根據(jù)各特異性引物片段大小設(shè)計(jì)合適的PCR反應(yīng)條件。反應(yīng)體系為：2×Taq DNA Mix 12.5 μL；cDNA 1.0～1.5 μL；TMV、CMV、PVY 和TVBMV 的引物濃度均為20 μmol/L，分別取上下游引物各0.5～1.5 μL；加ddH2O至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min；退火30 s；72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。設(shè)置退火溫度梯度：57.5、56.5、55.5、53.5、51.5 和50.5 ℃。

表1 各病毒的特異性引物序列Tab.1 Specific primer sequences for each virus

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草病葉總RNA 檢測(cè)

提取含病毒的煙葉總RNA，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1 所示。28 S 和18 S 條帶清晰，無DNA 條 帶；OD260/OD280 比 值 均 在1.7～1.9，表明蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)基本去除。LiCL 沉淀法提取的RNA 純度較理想，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 植物總RNA 檢測(cè)Fig.1 Plant total RNA detection

2.2 TMV 和CMV 的雙重PCR 檢測(cè)體系構(gòu)建

TMV 和CMV 在單獨(dú)擴(kuò)增條件下均能檢測(cè)出目標(biāo)病毒。然而，在與單獨(dú)擴(kuò)增TMV 和CMV 相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，雙重PCR 中CMV 未擴(kuò)增出條帶，將CMV 的上下游引物量從各0.5 μL調(diào)整至各0.8 μL，結(jié)果顯示CMV 和TMV 均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。使用該反應(yīng)體系，退火溫度設(shè)置為57.5、56.5、55.5、53.5、51.5 和50.5 ℃共6 個(gè)梯度。擴(kuò)增結(jié)果顯示，各退火溫度下均能擴(kuò)增出TMV 和CMV 目標(biāo)大小條帶（圖2）。

2.3 TMV、CMV和PVY的3重PCR檢測(cè)體系構(gòu)建

PVY 在與TMV 和CMV 相同的單重PCR 反應(yīng)條件下，反應(yīng)體系中PVY的上下游引物為各1.0 μL，進(jìn)行單重PCR，能夠擴(kuò)增檢測(cè)出目標(biāo)PVY，然而，在3 重PCR 中PVY 擴(kuò)增條帶較淡。因此，將PVY的cDNA 量調(diào)整至1.5 μL，上下游引物量調(diào)整為各1.0 μL，結(jié)果顯示CMV、TMV 和PVY 均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖2）。TMV 的目標(biāo)條帶隨著退火溫度的改變無明顯變化，CMV 隨著退火溫度的降低，擴(kuò)增條帶略淡，說明退火溫度55.5～57.5 ℃更適于TMV、CMV 和PVY 的3 重PCR 檢測(cè)。

2.4 TMV、CMV、PVY 和TVBMV 的4 重PCR 檢測(cè)體系構(gòu)建

2.4.1 TVBMV 引物篩選

利用TVBMV 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含體蛋白基因（Cylindrical inclusion protein gene，CI）、第1 蛋白基因（The first protein gene，P1）、細(xì)胞核內(nèi)含體蛋白a基因（Nuclear inclusion a gene，NIa）、細(xì)胞核內(nèi)含體蛋白b 基因（Nuclear inclusion b gene，NIb）、第3 蛋白基因（The third protein，P3）、第3 蛋白順反子內(nèi)的移碼蛋白基因PIPO或外殼蛋白基因（Coat protein gene，CP）對(duì)TVBMV 單獨(dú)侵染的材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均能獲得目標(biāo)條帶。對(duì)于復(fù)合侵染材料的檢測(cè)，在TMV、CMV和PVY的3重PCR反應(yīng)體系中，加入TVBMV各基因引物，僅PIPO在4重PCR中擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖3）。除了PIPO，TVBMV 其他基因在混合侵染樣品中難以擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，推測(cè)這與多重PCR 影響引物的特異性有關(guān)，也可能與TVBMV 與多種病毒復(fù)合侵染后相互間存在的拮抗效應(yīng)有關(guān)。

圖2 煙草病毒的多重PCR 檢測(cè)Fig.2 Multiplex PCR detection of tobacco virus

圖3 TVBMV 特異性引物篩選Fig.3 TVBMV-specific primer screening

2.4.2 TVBMV 在復(fù)合侵染中的分析

為驗(yàn)證TVBMV 在復(fù)合侵染中與其他病毒間的關(guān)系，在煙草上進(jìn)行復(fù)合接種，分別于接種后第3 天和第7 天取樣，根據(jù)構(gòu)建的4 重PCR 檢測(cè)體系對(duì)TMV、CMV、PVY 和TVBMV 進(jìn)行檢測(cè)。TMV、CMV 和PVY 在接種后的第3 天和第7 天均能擴(kuò)增出清晰的目標(biāo)條帶。接種后3 天可以檢測(cè)到TVBMV 的P1，CP和PIPO目標(biāo)條帶，但TVBMV的CP基因積累水平較低；在接種后第7 天，僅PIPO基因能夠檢測(cè)到明顯的目標(biāo)條帶，P1和CP基因的擴(kuò)增條帶較弱，結(jié)果見圖4。因此，進(jìn)一步以TMV、CMV 和PVY 的CP基因，TVBMV 的PIPO基因設(shè)計(jì)相應(yīng)引物組合，進(jìn)行四重PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化。

2.4.3 4 重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

在建立的3 重PCR 體系的反應(yīng)條件下，加入TVBMV 的PIPO特異性上下游引物以及cDNA 各1.0 μL，PCR 擴(kuò)增的目標(biāo)條帶較淡，因此，將PIPO的上下游引物以及cDNA 的加入量均調(diào)整至1.2 μL，設(shè)置退火溫度57.5、56.5、55.5、53.5、51.5 和50.5 ℃共6 個(gè)梯度，4 種病毒均能擴(kuò)增出較為清晰的目標(biāo)條帶（圖2）。

最終建立的CMV、TMV、PVY和TVBMV的4重PCR 檢測(cè)體系為：25 μL反應(yīng)體系中TMV、CMV、PVY和TVBMV的cDNA分別為1.0、1.0、1.5和1.2 μL，對(duì)應(yīng)的上下游引物分別為各0.5、0.8、1.0 和1.2 μL；2×Mix Taq 反應(yīng)液12.5 μL；0.2 μL ddH2O 補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；53.5 或55.5 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。根據(jù)CP基因設(shè)計(jì)CMV、TMV、PVY 的引物，根據(jù)PIPO基因設(shè)計(jì)TVBMV的引物。CMV、TMV、PVY 和TVBMV 擴(kuò)增大小分別約為700、452、275 和235 bp。

圖4 TVBMV 在復(fù)合侵染中的檢測(cè)Fig.4 Detection of TVBMV in complex infection

3 討論

多重PCR 要求在同一反應(yīng)體系中，進(jìn)行多個(gè)引物序列的特異結(jié)合和擴(kuò)增，引物濃度和模板量是影響多重PCR 的重要因素，因此，一個(gè)理想的多重PCR 體系需要針對(duì)引物序列、模板量、引物濃度和退火溫度條件等進(jìn)行綜合優(yōu)化，建立適宜的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件［14］。在本研究中，PVY 和TVBMV 的擴(kuò)增效率較低，通過在多重PCR 中增加模板量和引物濃度，擴(kuò)增效率得到提高。

根據(jù)鄭軒等［12］利用TMV、CMV、TEV、PVY 和TVBMV 的外殼蛋白基因序列建立的多重PCR 檢測(cè)體系能夠擴(kuò)增出TMV、CMV 和PVY 的目標(biāo)條帶，然而對(duì)復(fù)合侵染中TVBMV 的檢測(cè)卻不夠穩(wěn)定，推測(cè)這與TMV、CMV、PVY 的株系差異，以及病毒間的相互作用有關(guān)。通過復(fù)合侵染的人工接種實(shí)驗(yàn)，明確TVBMV 明顯受到其他幾種病毒的拮抗作用，進(jìn)而降低了復(fù)合侵染中TVBMV 的檢出率。在多重PCR 的各基因引物篩選中，發(fā)現(xiàn)TVBMV 的PIPO基因能夠在4 重PCR 反應(yīng)中產(chǎn)生較明顯的條帶。PIPO是PVY 屬病毒中一個(gè)位于P3基因序列內(nèi)，從第2 個(gè)核苷酸開始翻譯合成的編碼框。然而，TVBMV 的其他基因則通過單個(gè)大開放閱讀框（Open reading frame，ORF）進(jìn)行表達(dá)，編碼一個(gè)大約由3 000 個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白［15］。因此，推測(cè)PIPO的復(fù)制策略不同于TVBMV的其他基因，使得PIPO的mRNA 豐度有所差異。本研究基于TMV、CMV 和PVY 的CP基因并結(jié)合TVBMV 的PIPO基因，通過PCR 反應(yīng)條件和體系的優(yōu)化建立的4 重PCR 檢測(cè)體系提高了復(fù)合侵染樣品中TVBMV 檢測(cè)的靈敏度。

4 結(jié)論

篩選出了TVBMV 的PIPO基因并結(jié)合TMV、CMV、和PVY 的CP基因設(shè)計(jì)引物，通過調(diào)整引物和反應(yīng)模板的濃度，優(yōu)化反應(yīng)條件，擴(kuò)增獲得大小分別約為700、452、275 和235 bp 的PCR 產(chǎn)物，建立了針對(duì)CMV、TMV、PVY 和TVBMV 4 種常見煙草病毒的多重RT-PCR 檢測(cè)體系，為田間復(fù)合侵染的煙草病毒提供了一項(xiàng)更加高效的檢測(cè)手段。