煙草查爾酮異構酶基因2（NtCHI2）功能分析

翟 妞，鄭慶霞，劉萍萍，徐國云，張 慧，李 晶，陳千思，武明珠，周會娜*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001 2. 云南中煙工業有限責任公司技術中心，昆明市五華區科醫路41 號 650106

黃酮類化合物是一種小分子酚類物質，是植物次生代謝的主要產物之一，具有調節植物生長、保護植物免受紫外線損傷、抗病蟲、抗氧化等功能［1-2］。煙草黃酮類化合物不僅對煙株生長發育起重要作用，該類化合物，尤其是其中的蕓香苷含量對煙葉品質有直接影響［3-4］。目前黃酮類化合物的代謝途徑相對清楚，黃酮類代謝起始于苯丙烷代謝，由查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）引向黃酮類合成［5-6］。查爾酮異構酶（Chalcone isomerase，CHI）是黃酮類合成代謝的一個關鍵節點酶［7］，在黃酮類物質的代謝通路中催化查爾酮柚（苷）配基4，5，7-三羥黃烷酮轉化合成柚（苷）配基4，5，7-三羥黃烷酮（異黃酮的前體），由此進入異黃酮代謝支路［8-9］，蕓香苷就是此支路的產物。賈宏昉等［10］的研究表明，CHI基因在不同生態區濃香型烤煙中的表達差異明顯，提示其可能在黃酮類物質形成中起關鍵作用。栽培煙草中的CHI基因有2 個拷貝，即NtCHI1和NtCHI2，NtCHI1的功能已經驗證過［11］，NtCHI2的功能還未見報道。

本課題組前期多組學關聯分析發現，鮮煙葉中蕓香苷的含量與NtCHI2正相關，相關系數為0.72。本研究中以NtCHI2過表達和干擾株系為研究對象，通過qPCR 定量分析基因NtCHI2的表達，進一步結合體內體外查爾酮異構酶活性分析和體內蕓香苷含量測定，驗證NtCHI2基因的功能，為蕓香苷的合成代謝調控提供新靶標，也為創制新型煙草材料提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 煙草材料

NtCHI2（Ntab0103790.1）過表達轉基因株系（CHI-1、CHI-2、CHI-3）和干擾株系（RNAi-1、RNAi-2、RNAi-3、RNAi-4、RNAi-5）為本實驗室前期構建，對照株系（CK）為K326，溫室培育；8～10 葉期時，采集第4 片葉，立即液氮冷凍，-80 ℃保存。

1.1.2 試劑

RNApre pure 植物總RNA 提取試劑盒購自北京天根生物技術有限公司；第一鏈合成反轉錄試劑盒購自美國Roche 公司；熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master 購自美國Roche 公司；蛋白定量試劑盒Pierce ? BCA Protein Assay Kit 購自美國Thermo 公司；查爾酮異構酶活性檢測試劑盒購自上海晶抗生物科技有限公司；引物由擎科生物（鄭州）工程有限責任公司合成；其他常規試劑均為購自中國醫藥集團有限公司的分析純試劑。蛋白提取NE 緩沖液，實驗室自配（20 mmol/L Hepes（pH 7.5），40 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF）。甲酸、乙腈、無水乙醇（色譜純，美國Merck 公司）；標準品（山奈酚、綠原酸、東莨菪亭、東莨菪苷、花青素鼠李糖苷、蕓香苷、山奈酚-3-糖、槲皮素和鼠李金）購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.1.3 儀器

PL-602L 和MS105 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、PURELAB Pulse 超純水一體化系統（英國ELGA 公司）、FRESCO 21 冷凍臺式離心機（美國Thermo 公司）、Nanodrop 2000 超微量分光光度計（美國Thermo 公司）、PCR System 9700 熱循環儀（美國AB 公司）、MK2000-2E 恒溫金屬浴（杭州奧盛儀器有限公司）、LightCycler?96 實時熒光定量PCR 儀（美國Roche 公司）、Spectra Max plus 384 酶標儀（美國MD 公司）、1290/6490 超高效液相色譜/三重四極桿串聯質譜聯用儀（美國Agilent 公司）、25 EL5 冷凍干燥機（美國Genesis公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙草葉片RNA 提取及cDNA 制備

將煙葉樣品在液氮中充分研磨后，取10 mg 粉末，參考張慧等［12］的方法進行RNA 的提取和cDNA 的制備。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qPCR）

qPCR 反 應 條 件：95 ℃10 min；95 ℃10 s，55 ℃10 s，72 ℃10 s，共40 個 循 環；95 ℃5 s，65 ℃1 min，以0.1 ℃/s 升溫至97 ℃。

以β-actin為內參基因，內參基因和目的基因各重復3 次，結果以平均值表示。每個樣品組的目的基因NtCHI2/內參基因β-actin的比值代表基因的表達水平變化。內參基因β-actin，正向引物：5'-CT GGCATTGCAGATCGTATA-3'；反向引物：5'-GCGCC ACCACCTTGATCTT-3'。目的基因NtCHI2，正向引物：5'-GATTCAATTACTGGCACTC-3'；反向引物：5'-TCGGCGATACTACACTTT-3'。具體qPCR擴增體系及計算參考張慧等［12］的方法。

1.2.3 煙草葉片總蛋白提取及定量

1.2.3.1 蛋白提取

將采集的煙葉樣品在液氮中充分研磨，稱取100 mg 粉末，加入1 mL 全蛋白提取緩沖液NE；參考翟妞等［13］的方法進行煙葉全蛋白的提取。

1.2.3.2 蛋白定量

取上清液，稀釋10 倍，按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明進行實驗。根據所測樣品的吸光值，依據標準曲線獲得相應的蛋白質量（μg），除以樣品稀釋液總體積并乘以樣品稀釋倍數即為樣品實際濃度（μg/μL）。

1.2.4 查爾酮異構酶活性檢測

每個株系采集第4 葉位葉片，按照查爾酮異構酶活性檢測試劑盒說明書進行檢測。3 次重復，對結果進行T檢驗分析。

查爾酮異構酶活性（U/μg 全蛋白）=樣品的活性濃度×上樣體積/上樣蛋白總量

1.2.5 查爾酮異構酶體外表達活性檢測

利用本實驗室已構建好的體外表達質粒pQE30-NtCHI2，轉化BL21 細胞，挑取單克隆菌斑置入150 mL 錐形瓶中，37 ℃180 r/min 恒溫培養，至OD 值為0.6～1.0 時，0.5 mol/L IPTG 誘導表達，37℃180 r/min 恒溫培養3 h。收集菌液，4 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清液，加入蛋白裂解液RIPA 5 mL，混勻后冰上超聲提取，13 000 r/min 離心15 min，取上清液，利用1.2.4 節的方法進行酶活性測定。

1.2.6 蕓香苷含量檢測

取煙葉凍干粉末20 mg 于2 mL 離心管中，加入1.5 mL 提取液（75%甲醇溶液，含內標傘形花內酯，質量分數為2.5 mg/mL），渦旋6 s后超聲提取1 h后，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，參考劉萍萍等［14］的方法測定蕓香苷含量。6 次檢測重復，對結果進行T-test 差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 查爾酮異構酶基因過表達株系和干擾株系中NtCHI2 的表達量

對實驗室培育的NtCHI2過表達株系和干擾株系的葉片樣品進行定量分析，結果（圖1）發現：和對照株系比，過表達株系中NtCHI2的表達量增加5 倍至75 倍（圖1a），基因表達上調顯著；和對照株系比，干擾株系中NtCHI2的表達量下降約30%～70%（圖1b），基因表達下調極顯著。

圖1 NtCHI2 在過表達株系（a）和干擾株系（b）中的表達差異Fig.1 Relative expression levels of NtCHI2 in NtCHI2-OE（a）and NtCHI2-RNAi（b）strains

2.2 查爾酮異構酶基因過表達株系和干擾株系中CHI 的活性

對NtCHI2過表達株系和干擾株系的葉片樣品在基因定量的基礎上，進行CHI 的酶活檢測。結果（圖2）發現，和對照株系比，NtCHI2過表達株系中CHI 酶的活性沒有顯著差異（圖2a），而干擾株系中CHI 酶的活性顯著降低，各株系分別降低34.2%、57.6%、46.8%、51.4%和61.6%（圖2b）。說明在煙草中過表達NtCHI2對CHI 酶活的影響不大，而降低NtCHI2基因表達量則會顯著降低CHI酶的活性。

圖2 NtCHI2 過表達株系（a）和干擾株系（b）中CHI 的活性差異Fig.2 CHI activities of NtCHI2-OE（a）and NtCHI2-RNAi（b）strains

2.3 體外表達查爾酮異構酶的活性

通過構建好的表達菌株pQE30-CHI2/BL21 誘導表達CHI2 蛋白，提取全蛋白進行CHI 酶活性檢測。結果（圖3）表明：體外表達CHI2 的酶活性為1.4×10-4U·μg-1全蛋白，而空載體對照幾乎為零。說明煙草NtCHI2的表達產物具有CHI 酶活性。

圖3 NtCHI2 表達菌株中CHI 酶的活性Fig.3 CHI activity of strains with NtCHI2 expression

2.4 查爾酮異構酶基因過表達株系和干擾株系中蕓香苷含量

對實驗室培育的NtCHI2過表達株系和干擾株系的葉片樣品在基因定量和酶活性檢測的基礎上，進行蕓香苷含量檢測。結果（圖4）發現：和對照株系比，NtCHI2過表達株系中蕓香苷的含量變化不明顯（圖4a），而干擾株系中蕓香苷的含量顯著降低，不同株系可分別降低90.5%、72.4%、91.3%、88.8%和85.4%（圖4b）。說明干擾株系中，NtCHI2的表達量降低，對應的CHI 酶的活性也隨之降低，影響了后續的黃酮類化合物蕓香苷的代謝。

圖4 NtCHI2 過表達株系（a）和干擾株系（b）中蕓香苷的含量差異Fig.4 Rutin contents in NtCHI2-OE（a）and NtCHI2-RNAi（b）strains

3 討論

本研究中發現NtCHI2的表達量與鮮煙葉中蕓香苷的含量正相關。但是與NtCHI1比，NtCHI2過表達株系中，CHI 活性和蕓香苷含量沒有變化，不過體外實驗（圖3）表明NtCHI2的體外表達產物確實具有CHI 酶活性。

NtCHI2與NtCHI1功能的差異，可能由以下原因引起：①NtCHI1由603 個核苷酸組成，NtCHI2由768 個核苷酸組成，均含有4 個外顯子，NtCHI23'端 比NtCHI13' 端 多165 個 核 苷 酸；②NtCHI1 由200 個氨基酸組成，NtCHI2 由255 個氨基酸組成，NtCHI2 C 端比NtCHI1C 端多55 個氨基酸；③搜索中 國 煙 草 基 因 組 數 據 庫（http：//10.6.0.76/）中NtCHI1 和NtCHI2 的結構信息，NtCHI1 的活性功能域為6～199 位的氨基酸，NtCHI2 的活性功能域為6～206 位的氨基酸，NtCHI2 比NtCHI1 多7 個氨基酸，為TIPEIGV。NtCHI2過表達株系中，CHI 活性沒變化，應該和其結構域中多出的7 個氨基酸有關。NtCHI2翻譯后的氨基酸修飾，抑制其CHI活性，與蕓香苷引發的反饋抑制無關，因為蕓香苷的含量并沒有增多。但具體是哪個氨基酸被修飾引起的NtCHI2 酶活性被抑制，需要后續實驗證實。

對NtCHI2功能的進一步驗證，確定其關鍵結構域中起關鍵作用的氨基酸，可以為后續通過分子手段干擾、定點突變等調控蕓香苷代謝提供精確靶點。對比其他通過栽培手段提高CHI 酶活性［15］或者利用轉錄因子調控關鍵酶基因的轉錄等［16-19］調控類黃酮代謝技術，通過分子手段對類黃酮代謝關鍵酶CHI 的活性進行靶向調控更為直接，效果也可能更好。

4 結論

NtCHI2表達蛋白具有查爾酮異構酶活性；過表達株系中，NtCHI2表達量明顯增加，但CHI 酶的活性和蕓香苷的含量基本沒有變化；NtCHI2干擾株系中，NtCHI2表達量顯著降低，CHI 酶的活性和蕓香苷含量也顯著降低。因此，NtCHI2基因表達量與煙葉蕓香苷含量具有一定的正相關關系，可通過抑制NtCHI2基因的表達進而提高煙葉中蕓香苷的含量。