預處理對果蠅唾腺染色體制片的影響

高汝勇

（衡水學院生命科學系 河北 衡水053000）

果蠅是經典遺傳學實驗的模式生物。果蠅3齡幼蟲是觀察唾腺染色體的優選材料[1]，果蠅唾腺染色體常染色質區的核蛋白纖維在分裂間期不斷復制，但復制產物卻不分開，結果成千上萬條染色質纖維平行排列成一個長為2 mm、寬為5 um的寬大帶狀物，因此成為多線染色體[2]。唾腺染色體上的橫紋具有特異性，染色體上發生的缺失、重復、易位等結構變異很容易在光學顯微鏡下通過橫紋的位置和數目來判斷。另外果蠅唾腺染色體也是觀察染色體形態特征，研究其化學組成、基因表達調控，以及進行各類神經疾病研究等的很好材料[3]。果蠅唾腺染色體觀察實驗是遺傳學的經典實驗之一，該試驗操作性很強，在學生制片過程中染色體往往聚成團，降低實驗效果。本試驗研究唾腺剖取前的一些試驗步驟，旨在提高唾腺染色體的伸展效果，提高試驗的成功率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和用品。果蠅，改良品紅、0.4%NaCl、0.75%NaCl、玉米粉、瓊脂、酵母粉、白糖、丙酸。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的制備。玉米粉15 g、瓊脂1.5 g、酵母1.4 g、水150 ml、白糖27 g、丙酸1.5 ml，制備5瓶培養基。

1.2.2 幼蟲培養。在250 ml的培養基中接種10對左右成蟲。大量幼蟲出現后，在培養基表面撒少許酵母粉，把幼蟲放在15℃～18℃的恒溫箱中培養。

1.2.3 唾腺染色體標本制備。在大量3齡幼蟲出現后，把幼蟲培養基放置在3℃～5℃的冰箱中，分別低溫處理12 h、24 h、36 h。挑選3齡幼蟲中已爬上瓶壁、行動遲緩、長約5 mm、半透明或者有些發黃但未化蛹的肥大幼蟲。剖取腺體、解離、水洗、改良品紅染色、壓片，顯微鏡下觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 肥大幼蟲的培養。按照如上配方，減少了5 g玉米粉的用量，制成的培養基比較松軟，發酵良好，非常適合果蠅幼蟲生長。大量低齡幼蟲出現后向培養瓶中加入的酵母粉可作為幼蟲的補充營養。把幼蟲放在15℃～18℃的恒溫箱中培養，能改變果蠅的生活周期，延長幼蟲階段的時間，能使幼蟲變得肥大，唾腺也相應增大，這樣有利于學生在解剖鏡下識別唾腺、剖取唾腺。

2.2 低溫處理效果分析

2.2.1 傳統實驗方法弊端。獲得合適3齡幼蟲后，傳統的實驗方法都是先剖出唾腺，然后直接用鹽酸進行解離，這種方法在后期制片時唾腺染色體不容易分散，必須費力用橡皮頭敲擊蓋片以利于染色體分散。但是學生在進行實驗時往往不好掌握敲擊的力度和時間，力度小、時間短沒有效果；力度過大、時間過長唾腺染色體又容易發生斷裂。

2.2.2 低溫處理后效果。3齡幼蟲經過低溫處理后可以改善唾腺染色體的伸展效果。本實驗在有大量3齡幼蟲出現后，把幼蟲培養基放置在3℃～5℃的冰箱中分別低溫處理12 h、24 h、36 h。之后按照常規方法剖取唾腺、鹽酸解離、水洗、染色、獲得制片，比較低溫處理在剖取唾腺染色體難易程度、脂肪剔除的難易程度以及染色體伸展程度上的區別，最終結果如表1。

表1低溫處理時間及其效果

根據表1我們可以看出，低溫處理12 h的3齡幼蟲最易剖取唾腺。低溫處理24 h之后，3齡幼蟲身體彈性降低，在剖取唾腺過程中身體容易斷裂，所以相比于低溫12 h的幼蟲較難剖取唾腺。低溫處理36 h的3齡幼蟲，身體已經完全沒有了彈性，經常一拉就斷，內容物流出，學生往往找不到食道，更不容易找到食道前端兩側的一對唾腺。在剔除脂肪的難易程度上可以發現，經過低溫處理的幼蟲比未經處理的幼蟲好剔除脂肪，并且隨著低溫時間的延長，脂肪量越少，處理36 h的幼蟲幾乎沒有脂肪，或者有很少量的脂肪，也容易用解剖針剔除。在染色體伸展效果上，低溫處理24 h的效果最好(如圖1)，其次是12 h的(如圖2)，36 h的效果最差(如圖3)。

圖1低溫處理24 h

圖2低溫處理12 h

圖3低溫處理36 h

圖4分散良好的唾腺染色體

2.3 解剖前低滲預處理。研究對比了在0.75% NaCl中直接剝取唾腺，在蒸餾水和0.4% NaCl分別低滲30 min、在0.75%NaCl中等滲30 min后再剝取的實驗，以便區分常規直接解剖與低滲處理后解剖在拉取唾腺、剔除脂肪的難易程度上的區別。

2.3.1 蒸餾水低滲30 min。在蒸餾水中低滲30 min后的幼蟲，由于吸水明顯變大很多，同樣唾腺染色體細胞也由于吸水變大，所以在解剖過程中唾液腺腺體很容易找到，并且脂肪都是聚集在一起的，一拉便可完全剔除。

2.3.2 0.4% NaCl低滲30 min。在0.4% NaCl中低滲30 min后的幼蟲及其唾液腺腺體雖然也會吸水膨脹，但沒有在蒸餾水中膨脹的大，因此在解剖的難易程度上，相比于蒸餾水處理過的稍微遜色一些，但仍是好剖取的。在染色體伸展狀況上，0.4%NaCl處理要比蒸餾水處理要好，伸展得更充分。

2.3.3 0.75% NaCl中等滲處理30 min再剖取唾腺和0.75%NaCl中直接剖取唾腺。在0.75% NaCl中等滲處理30 min后再剖取唾腺和在0.75%NaCl中直接剖取唾腺時，幼蟲頭部較小，不容易拉伸，唾腺也小，不容易尋找，并且脂肪分布雜亂，不容易剔除，效果較差。

3 結論與討論

多飼酵母粉和15℃～18℃條件下培養果蠅幼蟲，利于幼蟲的生長發育，可增加唾腺腺體體積，利于唾腺的識別和剖取。

將3齡幼蟲置于3℃～5℃低溫下處理24 h，利于唾腺剖取、脂肪體的剝離、染色體的伸展。在解剖果蠅之前，若用低滲溶液處理，細胞會吸水膨脹變大，有利于拉取唾腺和識別腺體，并且在壓片時，染色體能更好的分散[4]。本實驗發現，把低溫處理24 h后的3齡幼蟲在0.4% NaCl中低滲30 min，這樣制得的染色體制片成功率明顯比常規方法高很多(圖4)。這些在剖取唾腺之前的預處理步驟會大大提高實驗的成功率，解決常規方法中學生經常遇到的不好剖唾腺、不易找到腺體、染色體伸展不充分、細胞重疊等問題。