紅花多糖通過調控MMP-9抑制神經母細胞瘤侵襲、轉移的研究

瞿紅霞　高潔　張春泉　劉子龍　溫娟　胡兆鵬

【摘 要】目的：研究紅花多糖對神經母細胞瘤侵襲、轉移的作用及其作用機制。方法：用不同濃度的紅花多糖作用于人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞后進行細胞生物學功能實驗，研究其對神經母細胞瘤侵襲及轉移的影響;收集經不同濃度紅花多糖處理的SH-SY5Y細胞的mRNA和蛋白分別進行RT–PCR和Westernblot實驗。結果：紅花多糖抑制神經母細胞瘤細胞的增殖、侵襲和轉移;紅花多糖在轉錄水平下調MMP-9的表達。結論：在神經母細胞瘤細胞中，紅花多糖通過轉錄抑制下調MMP-9的表達，并通過靶向MMP-9抑制神經母細胞瘤細胞的體外侵襲、轉移。

【關鍵詞】紅花多糖;神經母細胞瘤;MMP-9;SH-SY5Y;生物學功能

【中圖分類號】R3【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019（2020）13--01

在臨床上，紅花常用于抗腫瘤復方中，大量的實驗相繼發現紅花抑制腫瘤的主要成分為紅花多糖（SPS）、紅花黃色素及紅花黃色素A，研究主要集中于肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤。將紅花用于神經母細胞瘤的研究非常少，紅花作用于該腫瘤的機理尚不明確。神經母細胞瘤（Neuroblastoma，NB）是起源于交感神經系統的惡性胎源性腫瘤。NB的病因目前并不明確，但目前越來越多的研究表明細胞外基質對腫瘤的侵襲和轉移過程起組織屏障作用，細胞外基質屏障的破壞會使得腫瘤細胞發生侵襲和轉移。

本研究觀察了紅花多糖對人神經母細胞瘤細胞株SH- SY5Y細胞的侵襲、轉移、增殖的作用，并且對它的作用機理進行了初步探討，為紅花多糖治療NB提供科學的實驗和理論依據。

1 試劑與儀器

紅花多糖購于成都德思特生物;人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y由華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院童教授提供;TRIPA總蛋白裂解液、MTT等購于武漢谷歌生物科技有限公司;ECL顯影液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天公司;Transwell小室購自美國Invetrogen公司。DMEM細胞培養基、胎牛血清（FBS）等購于Hyclone公司;GAPDH和MMP-9基因的引物購至擎科生物;逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司-大連寶生物有限公司。兔抗MMP-9抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔的二抗購于ABclonal公司;生物超凈臺購自蘇凈安泰公司;PCR儀購自DTC公司。

2 方法

2.1 細胞培養及分組 SH-SY5Y細胞株在DMEM培養液中培養，37℃、5% CO2培養箱中培養。實驗中所使用的SH-SY5Y細胞均處于對數生長期。待細胞融合至70～80%時，用胰酶消化，制備成細胞懸液并接種于細胞培養板中待細胞貼壁，生長良好后分別加入不同濃度的紅花多糖。實驗分為四組，其中第1組為對照組（加入PBS，紅花多糖濃度為0mg/ ml）、第2、3、4組為含有不同濃度的紅花多糖（濃度分別為0.16 mg/ml、0.32 mg/ml、0.64mg/ml）的實驗組[1]。

2.2 MTT比色法檢測細胞增殖抑制率 消化細胞，以3000個/孔細胞的密度接種于96孔板，每個孔分別加入200μl培養基，每種處理設8個重復。分別加入不同濃度的紅花多糖進行培養，48 h后吸棄培養液，每孔分別加入180μl培養基，并分別加入20μl MTT溶液（5 mg/μl），培養箱中繼續培育4 h后吸棄孔內培養基，每孔加入100 ml DMSO，用酶標儀測定吸光度（A）值，并計算增殖活性抑制率。

2.3 Transwell實驗檢測對細胞侵襲能力的改變 消化細胞，取一個24孔板，每孔加入500?l培養基（含20%血清），將小室放入24孔板;上層每孔加入200?l培養基（含5%血清及）及25000個細胞，混勻后在培養箱中培養;過夜后用棉棒擦掉小室上層細胞，加入500?l甲醇固定10-15min，PBS清洗，結晶紫染色，PBS清洗，顯微鏡下照相。

2.4 劃痕遷移實驗檢測對腫瘤細胞遷移能力的影響 消化細胞，以每孔1.25×105個細胞的密度種于24孔板，過夜后用10?l槍頭與24孔板底垂直做十字劃痕;用PBS清洗洗去劃下的細胞，分別加入不同紅花多糖濃度的完全培養基，放入培養箱中培育，分別于0、24、48h拍照。

2.5 Real-time PCR檢測MMP-9基因的mRNA表達 紅花多糖處理SH-SY5Y細胞24h后，收集細胞，每（5～10）×106個細胞中加入1mL Trizol，反復吹充分裂解細胞。加入200μL氯仿，充分震蕩混勻后室溫放置2～3min。4℃12000g離心15min，吸取上層水相至新EP管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，4℃靜置5～10min。4℃12000g，離心10min，離心后管壁和管底出現膠狀沉淀。加入1mL 75 %的乙醇，懸浮沉淀。4℃12000g離心5min，室溫晾干5min后加入20μL無Rnase的水，充分震蕩混勻。用分光光度計檢測總RNA的OD值并計算其濃度。然后進行逆轉錄，用于real-timePCR檢測，用StepOneSoftware分析軟件分析并輸出Ct值及熔解擴增曲線。

2.6 Western blot檢測MMP-9蛋白的表達 紅花多糖處理SH-SY5Y細胞48h后，收集細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，使用蛋白檢測試劑盒對所提取的蛋白進行濃度測定，測定后每管各加入1/4倍體積的5×SDS上樣緩沖液，把樣品放置于95℃的金屬浴鍋中變性10 min，變性后的蛋白用于上樣進行SDS-PAGE電泳并轉膜，轉膜結束后加封閉液封閉12 h，封閉過的膜加入MMP-9抗體4℃過夜。次日，TBST搖床洗膜，然后加入二抗（1：1000）室溫孵育1 h，TBST洗膜，增強化學發光劑（ECL）顯色，發光儀發光，記錄并保存結果;使用Photoshop、ImageJ處理分析數據。

2.7 統計學分析方法 實驗所得數據用均數士標準差（X士S）表示，通過SPSS 17. 0統計軟件的t檢驗和方差分析進行統計處理，取P<0. 05說明有差異，代表有統計學意義，用Graphpad Prism 5.0軟件進行繪圖。

3 結果

3.1 細胞生物學功能實驗：加入不同濃度的紅花多糖可使SH-SY5Y細胞的增殖能力顯著降低 （P<0.05） （圖3-1）、侵襲能力顯著降低（P< 0.05）（圖3-2）、遷移能力顯著下降 （圖3-3），且隨著紅花多糖的濃度增加，對SH-SY5Y細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用越明顯。

3.2 加入不同濃度的紅花多糖可使人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞中MMP-9的轉錄本（mRNA）和蛋白表達水平顯著下調（P< 0.05，圖3-4和圖3-5）。

4 討論

惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康并危及生命，轉移是腫瘤患者死亡的首要原因。NB是最常見的起源于神經脊的外周神經系統實體瘤，占兒童腫瘤死亡病例總數15 %左右。在影響腫瘤轉移的諸多因素中，MMPs與腫瘤轉移關系非常密切。MMPs活性的增加與乳腺、肺、結腸等多種惡性腫瘤的侵襲和轉移相關[2]，它能導致細胞外基質降解，使得腫瘤細胞能夠突破細胞外基質組成的屏障，從而導致腫瘤細胞發生浸潤和轉移[3]。MMP-9是MMPs中很重要的一員，在多種類型腫瘤中MMP-9表達水平上調，且MMP-9高表達患者預后較差，生存時間相對較短。程瑜等的研究已經證實在NB組織中 MMP-9的表達是上調的，但是MMP-9在 NB組織中的表達調控機制仍不明確[4]。下調MMP-9，是抑制腫瘤轉移，延長腫瘤患者生存時間的突破口。

從中藥中尋找下調MMP-9，對抗腫瘤侵襲和轉移的藥物，對推進我國中醫藥現代化具有非常重要的意義。紅花多糖提取自中藥紅花，大量研究表明紅花多糖具有抗腫瘤、抑制血小板聚集、調節機體免疫等多種作用[5]，紅花多糖抗腫瘤的機理是抑制新生血管生成，以及抑制腫瘤細胞增殖。本研究重點探討紅花多糖對神經母細胞瘤SH- SY5Y細胞增殖、侵襲、轉移的作用。

我們的研究發現在神經母細胞瘤中，紅花多糖通過轉錄抑制下調 MMP-9的表達，且紅花多糖可以通過下調MMP-9抑制神經母細胞瘤侵襲和轉移;而且紅花多糖可使神經母細胞瘤的增殖能力降低，但是不知道確切機制，需要進一步研究闡明。這項研究拓展了我們關于紅花多糖在轉錄水平調節MMP-9的認識，且表明紅花多糖可以作為NB新治療靶標的潛在價值。

隨著對中藥的研究不斷深入，某些中藥的研究已表現出較好的開發前景。但目前很多研究還局限于實驗性研究，相信隨著研究的不斷深入，中藥抑制MMPs抑制腫瘤侵襲和轉移的機理會有更大的突破，并進一步實現臨床應用。

參考文獻：

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王珍珍，陳良良.中藥抑制基質金屬蛋白酶抗腫瘤轉移的研究進展[J].黑龍江中醫藥，2015，（2）：72-73.

鄧路嬋，周黎明.基質金屬蛋白與惡性腫瘤轉移的關系[J].四川生理科學雜志，2014，36（2）：80-82.

程瑜，孫立榮.基質金屬蛋白酶及其抑制因子與神經母細胞瘤侵襲轉移的關系[J].臨床研究，2005，27（3）：164-166.

孫偉，童仕倫，鄭勇斌.紅花多糖對人結腸癌 LoVo 細胞增殖、凋亡、侵襲作用機制研究[J].藥學研究，2016，20（ 6）：1049-1050.