基于全基因組測序技術的早期及晚期稽留流產遺傳學分析

陳惠英，范舒舒，許紅雁，彭紅梅，張 潯，黃笑英

(粵北人民醫院 1.生殖遺傳中心；2.婦產科，廣東 韶關 512000)

稽留流產指妊娠不足28周、胎兒體質量不足1 000g，胚胎發育自然終止(包括胎心消失及無胚芽、無胎心)但未排出宮腔，其是自然流產前的病理性過程[1]。稽留流產在我國發生率為13%，且有上升趨勢。稽留流產的發生與遺傳、環境、子宮畸形、免疫、內分泌等多種因素相關，其中，遺傳因素尤其是染色體異常占60%[2]。稽留流產的絨毛/胎兒組織染色體檢查有助于查找其原因，對再生育的優生遺傳咨詢有積極的應用價值。隨著全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)技術的發展，鑒于通量高、精確、報告周期短等特點，在臨床上的應用得到不斷推廣[3]。本研究主要應用WGS技術對早期及晚期稽留流產絨毛/胎兒組織進行遺傳學分析，探討稽留流產發生的遺傳學原因。

1資料與方法

1.1研究對象

對2018年9月至2019年10月在粵北人民醫院婦產科就診的188例稽留流產絨毛/胎兒組織進行染色體檢查，

選取2018年9月至2019年10月在粵北人民醫院婦產科就診，超聲確診為胚胎停止發育/胎死宮內，排除孕期感染等原因，采用WGS技術查找稽留流產原因的患者共188例，患者年齡為21～46歲，孕齡為6～27+6周。檢測前，患者知情同意并簽字。

1.2檢測方法

1.2.1取樣

小孕周無法取得胎兒組織時，取約10mg絨毛組織樣本；可見胎兒組織時，取約1cm×1cm胎兒組織樣本。使用生理鹽水多次漂洗樣本，去除污染物后放至無菌標本專用瓶內冷凍保存；使用EDTA真空采血管，采集母體外周血全血2mL，用于做STR基因分析，以鑒別母源性污染，提取的絨毛/胎兒組織樣本及母體全血交由深圳華大臨床檢驗中心檢測。

1.2.2檢測步驟

①提取DNA：室溫下解凍標本，剪碎研磨絨毛/胎兒組織后加入消化液，混勻后離心5min(2 000r/min)，去除上清液后PBS清洗，倒入1.5mL的EP管中，加入200μL Buffer AL震蕩混勻，56℃溫育10min后瞬時離心，加入200μL無水乙醇混勻，使用過濾柱離心1min(6 000×g)，添加Buffer AW 1 500μL再次離心1min(6 000×g)，添加Buffer AW 2 500μL后離心3min(6 000×g)，拿出過濾柱，加入Buffer AE 50μL后離心1min(6 000×g)；②短串聯重復序列分析(short-sequence tandem repeat，STR)技術：排除樣本母源細胞污染、檢測染色體非整倍體；③WGS技術的檢測：采用瓊脂糖凝膠電泳分析檢測污染情況及DNA的完整性，采用Nanodrop檢測DNA的純度；④文庫的構建：經末端修復、接頭連接、接頭連接產物純化、PCR反應、PCR產物純化等步驟，定量檢測后進行核酸納米球制備、Qubit質控，用BGISEQ-500平臺進行測序，分辨率為5Mb。運用比對軟件對測序數據進行分析，將不同測序序列標簽與相應染色體匹配。參考基因組為GRCh37/hg19。

1.3統計學方法

運用SPSS 22.0統計軟件分析數據。計數資料采用頻數和構成比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1早期及晚期稽留流產絨毛/胎兒組織染色體異常情況

在188例稽留流產絨毛/胎兒組織中，有182例成功地進行了WGS技術檢測，另有6例因DNA降解問題檢測失敗，檢測成功率為96.81%。在182例稽留流產絨毛/胎兒組織中，染色體正常89例，染色體異常93例，異常率為51.10%。稽留流產染色體異常包括數目異常79例(84.95%)、嵌合體10例(10.75%)、染色體片段缺失/重復4例(4.30%)。

按孕周進行分組，早期稽留流產(<12周)138例，染色體異常79例，異常率為57.25%；晚期稽留流產(≥12周)44例，染色體異常14例，異常率為31.82%，兩組染色體異常率比較差異有統計學意義(χ2=8.63，P=0.00)。

2.2早期及晚期稽留流產絨毛/胎兒組織染色體異常類型

早期稽留流產染色體數目異常占82.28%(65/79)、嵌合體占12.66%(10/79)、染色體片段缺失/重復占5.06%(4/79)；晚期稽留流產均為染色體數目異常，未見嵌合體及染色體片段缺失/重復，見表1。

表1 182例稽留流產絨毛/胎兒組織WGS檢測結果(n)

2.3染色體異常情況分析

在182例稽留流產絨毛/胎兒組織中，染色體異常93例。

在93例染色體數目異常中，三體型56例，X單體12例，多倍體(69，XNN)5例，多重三體異常(48，XN，+5，+21；48，XXY，+18；48，XXY，+13)6例；在10例嵌合體中，16-三體嵌合1例(嵌合比例為58%)，21-三體嵌合1例(嵌合比例為56%)，X單體嵌合6例(嵌合比例分別為78%、74%、59%、21%、39%、57%)，18-三體嵌合2例(嵌合比例分別為61%、70%)；在4例染色體片段缺失/重復中，1例1號染色體長臂重復22.96Mb，1例5號染色體長臂微重復27.44Mb，1例15號染色體長臂缺失7.53Mb，1例16號染色體短臂微缺失23.58Mb。

3討論

3.1染色體異常為稽留流產的原因

本研究通過WGS技術對稽留流產的絨毛/胎兒組織染色體進行分析，發現染色體異常率高達51.10%，早期稽留流產的染色體異常率為57.25%，晚期稽留流產的染色體異常率為31.82%，早期稽留流產染色體異常率明顯高于晚期稽留流產，與相關文獻[3-4]報道一致，提示遺傳因素為早期稽留流產的主要原因，也是晚期稽留流產的原因之一。因此，早期稽留流產的遺傳學原因檢查尤為重要，并對優生優育指導有重要意義。對不明原因及有再生育需求的稽留流產者，建議常規檢查流產組織的染色體，對絨毛/胎兒組織染色體異常者，必要時需進一步檢查父母雙方的染色體。

3.2稽留流產以染色體數目異常為主

本研究中，稽留流產絨毛/胎兒組織染色體數目異常比例較高，數目異常占所有染色體異常的84.95%，其中三體型所占的比例最高，主要為2、13、14、15、16、18、20、21、22-三體型，其中22-三體、16-三體、X單體在染色體異常中所占比例較高，這些異常均具有致病性。由于染色體數目異常(非整倍體、單體)及大比例的異常染色體嵌合導致了胚胎無法正常發育而引發流產。16-三體是人類最常見的且被稱為致死性胚胎的常染色體三體，是早期稽留流產(<12周)中最常見的染色體異常情況，與相關文獻[5]報道基本相符。大部分染色體數目異常均為減數分裂異常所致，多數表現為遺傳缺陷大，具有極高的胚胎致死性，多數發生早期流產，僅極少數存活出生[6]。

本研究檢測出染色體結構異常4例，染色體片段缺失/重復的片段長度為7.53～27.44Mb。在臨床致病性基因組拷貝數變異(copy number variation，CNV)中，涉及大量在線人類孟德爾遺傳(online Mendelian inheritance in man，OMMI)基因，包括多種致病性微缺失/微重復綜合征，可造成胎兒停止發育、多發畸形、宮內生長遲緩等臨床結局[7]。

3.3 WGS技術在稽留流產遺傳學原因分析中的優勢

臨床上有G顯帶核型分析法、熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization，FISH)等多種檢查染色體的技術。G顯帶核型分析法需要將流產絨毛組織進行細胞培養，可檢測出三倍體、平衡易位、倒位及大片段缺失/重復等異常，但分辨率低，對小于10Mb的異常染色體無法檢測[8]。熒光原位雜交法分辨率高，但該技術僅對13、16、18、21、22、X和Y這7條染色體的數目進行檢測，其無法對整個染色體組進行檢測，且有漏診的可能[9]。由于稽留流產組織陳舊，細胞培養成功率低，常規染色體胚胎往往無法獲得準確的結果。WGS技術成熟、檢測速度快、分辨率高，且能覆蓋全基因組，每次可對幾十萬到幾百萬個DNA分子進行序列測定，可以彌補G顯帶核型分析法和熒光原位雜交法的不足[10]。基于WGS技術的高效、準確，建議對稽留流產絨毛/胎兒組織染色體常規進行WGS檢測、查找遺傳學原因，為患者提供科學的再生育風險評估指導。