凍融長期冷凍保存胚胎對妊娠結局的影響

蘆亞瓊，何鈺輝，王 芳，柳勝賢

(鄭州大學附屬洛陽中心醫院生殖中心，河南 洛陽 471000)

目前，隨著我國“二孩”政策的實施，在生殖中心接受過體外受精一代(in vitro fertilization，IVF)或二代試管嬰兒(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療且有多余冷凍胚胎的家庭對“二孩”需求較為明顯。隨著胚胎冷融技術的發展，累積妊娠率也隨之顯著提高[1]。目前國內冷凍胚胎最長且成功分娩健康胎兒的時限為16.8年，然而長期冷凍胚胎的使用安全性依然缺乏明確的臨床證據。2018年冷凍胚胎保存時限的中國專家共識指出胚胎冷凍保存6年內不影響胚胎復蘇后存活率、著床率、妊娠率、活產率及子代出生缺陷率；建議胚胎冷凍保存期限不超過10年[2]。胚胎冷凍時間超過6年對凍融胚胎移植(frozen embryo transfer，FET)安全性是否有影響尚無足夠證據證實[3]，長期冷凍胚胎的妊娠結局目前仍存有爭議。

1資料與方法

1.1研究對象

收集在洛陽市中心醫院生殖中心行IVF/ICSI后，于2017年1月至2018年12月解凍移植且胚胎冷凍保存時間超過6年的病例為長期冷凍保存組，入選患者有28個周期77枚胚胎，長期冷凍保存組納入的病例均至少有一次新鮮移植周期或解凍周期的成功分娩史；另收集該時間段解凍移植周期胚胎冷凍保存時間為3～5年的病例作為短期冷凍保存組，入選患者有125個周期264枚胚胎。所有研究對象都簽署了知情同意書。

1.2胚胎冷凍與解凍

新鮮取卵周期冷凍策略為：正常受精后第三天(D3)獲得的最佳胚胎選擇冷凍或者移植2枚，D3冷凍胚胎均為4～9細胞Grade評分Ⅰ級或Ⅱ級，按照Istanbul consensus標準評分。入選的患者胚胎冷凍包括兩種方法：慢速程序化冷凍和快速玻璃化冷凍。前者選用Quinn’s成品胚胎冷凍液，冷凍液成分為：1.5M(mol/L)丙二醇+0.1M蔗糖+12mg/mL人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)，1.5M丙二醇+12mg/mL HSA，含有12mg/mL HSA的冷凍緩沖液。程序化冷凍對應的解凍試劑應用Quinn’s成品胚胎解凍液進行解凍，解凍液成分包括：0.5M蔗糖+12mg/mL HSA，0.2M蔗糖+12mg/mL HSA，含有12mg/mL HSA的解凍緩沖液。后者選用加藤冷凍及解凍試劑，按說明書步驟進行操作。

有研究指出慢速程序化冷凍和快速玻璃化冷凍這兩種方法對臨床結局無明顯影響[4-6]，但快速玻璃化冷凍方法操作方便。2012年以來本中心已普遍采用玻璃化冷凍方法，因此分布的差異不具有參考價值。

1.3子宮內膜準備

復蘇周期的方案均為人工周期。

1.4統計學方法

2結果

2.1兩組患者基本資料的比較

長期冷凍保存組納入28個周期，新鮮周期冷凍胚胎289枚，解凍胚胎77枚，解凍且存活胚胎74枚，移植胚胎50枚；其中共有3個解凍周期胚胎養囊胚移植，該3個解凍周期的13枚胚胎養成3枚囊胚。短期冷凍保存組納入125個周期，冷凍胚胎884枚，解凍胚胎264枚，解凍且存活257枚，移植胚胎232枚。兩組取卵周期及解凍周期女方年齡、解凍周期子宮內膜厚度比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；不孕類型、受精類型、剖宮產史的差異比較也均無統計學意義(均P>0.05)；兩種冷凍方法分布比較差異有統計學意義(P<0.05)。納入的兩組基本資料見表1。

表1 兩組研究對象的基本資料比較結果

2.2兩組解凍移植周期臨床結局的比較

本中心近三年(2016年至2018年)總體解凍復蘇率為98.90%(6 616/6 689)，臨床妊娠率、種植率、流產率及活產率分別為49.62%(1 703/3 432)、34.47%(2 239/6 495)、19.26%(328/1 703)、37.88%(1 300/3 432)。

兩組解凍移植周期的復蘇率及臨床妊娠率比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；長期冷凍保存組的流產率高于短期冷凍保存組，而活產率低于短期冷凍保存組，差異均有統計學意義(均P<0.05)；兩組分娩孕周及活產的新生兒體重比較差異均無統計學意義(均P>0.05)，此外兩組子代均無出生缺陷。凍胚移植臨床結局情況見表2。

表2 兩組凍胚移植的臨床結局比較結果

3討論

3.1凍存胚胎策略的現狀

胚胎凍融技術有效地提高了取卵周期胚胎的利用率和累積妊娠率，降低了患者的治療費用；全胚冷凍保存可有效降低卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的發生率，從而提高了輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)治療的安全性[7]。有大樣本數據指出，FET與新鮮胚胎移植的臨床妊娠率沒有明顯差異[8-9]，但FET周期較控制性超促排卵(controlled superovulation，COS)鮮胚移植周期，子宮內膜發育和內膜準備控制的更精細，可形成更好的內膜容受性，因此有研究提出實施常規COS全胚冷凍方案[10]。

3.2長期凍存胚胎對臨床結局的影響

隨著冷凍胚胎數的不斷增多，由此出現不少胚胎冷凍保存數年而無人問津。有報道胚胎冷凍時限超過10年解凍移植成功分娩的案例[11-12]。快速玻璃化冷凍已代替慢速程序化冷凍方法，但快速玻璃化冷凍依然會引起胚胎復蘇發育阻滯，高濃度玻璃化保護劑可能對FET子代健康產生負面影響，雖已有證明FET可獲得健康嬰兒[13-14]，但也有學者提出胚胎冷凍時間過長有可能影響基因的穩定性，造成胚胎DNA碎片的增加、線粒體DNA的突變等[15]，進而對胚胎的活力、種植能力及長期安全性造成影響。FET的長遠安全性仍需要大數據的臨床觀察及妊娠隨訪結局去驗證。

本研究對我中心2010年至2015年冷凍胚胎解凍移植的數據進行統計分析，發現胚胎冷凍保存年限超過6年的解凍復蘇率及臨床妊娠率較胚胎冷凍時限3～5年的比較差異無統計學意義，但長期冷凍保存組的流產率較高，且活產率較低，提示胚胎冷凍保存年限超過6年可能會對胚胎的發育產生不良影響，進而導致不良的妊娠結局；而長期冷凍保存組新生兒體重及出生時的孕周與短期冷凍保存組比較均無明顯差異，提示長期冷凍保存過程可能對胚胎早期發育潛力有不利的影響，對妊娠中后期的胎兒發育無明顯影響，但影響胚胎發育機制尚需動物實驗及長遠臨床隨訪數據深入探討并驗證。