重組人骨形成蛋白-4對人成骨樣細胞MG-63增殖分化的影響

胡 駿，張俊溢，劉雯君，黃文霞

(1.廈門大學附屬中山醫(yī)院口腔科，福建 廈門 361000；2.廈門市第五醫(yī)院口腔科，福建 廈門 361000；3.廈門醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院種植2科，福建 廈門 361000；4.廈門醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院牙周科，福建 廈門 361000)

正畸矯治過程中，溫和而持續(xù)的矯治力作用于牙體，使牙槽骨改建，引起牙齒移動。牙齒移動正是在成骨細胞的骨形成與破骨細胞的骨吸收這樣一個成骨—破骨的動態(tài)平衡中進行[1]。牙周膜細胞、成骨細胞以及破骨細胞等多種細胞參與牙槽骨的動態(tài)平衡改建[2]。成骨細胞是骨形成和骨改建中重要的功能細胞，成骨細胞增殖及分化能力直接影響到牙槽骨的改建過程。在機械壓力的刺激作用下，成骨細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導通路被激活，參與調(diào)節(jié)牙槽骨代謝與改建[2]。骨形成蛋白-4屬于骨形成蛋白家族和TGF-β家族，通過調(diào)控成骨細胞生長增殖、分化、遷移及凋亡能力，對軟骨及骨的形成與修復具有重要的誘導作用[3]。本文探討重組人骨形成蛋白-4(recombinant human bone morphogenetic protein-4，rhBMP-4)對體外培養(yǎng)的人成骨樣細胞MG-63 的增殖和分化活性的影響，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)；MTT(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；堿性磷酸酶測定試劑盒、羥脯氨酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；二甲基亞砜(美國Merck 公司)、Triton X-100(美國Sigma 公司)；ELx800UV 酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BioTek公司)。

1.2 細胞株及其培養(yǎng)

人成骨樣細胞系MG-63 由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)在體積分數(shù)為5%的CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，平均2 d更換1次培養(yǎng)液，每隔3～4 d進行1次細胞傳代。

1.3 MTT比色法測定細胞增殖率

用胰酶消化法將對數(shù)生長期MG-63 細胞制成6×104個/mL 細胞濃度的細胞懸液，每孔100 μL細胞懸液均勻接種于96孔培養(yǎng)板，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁后，更換含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液同步化24 h后，低、中、高rhBMP-4 組分別加入終濃度為5、10、20 ng/L 的 rhBMP-4，空白對照組只加DMEM 培養(yǎng)液、陰性對照組加MG-63 細胞和DMEM 培養(yǎng)液，每組設5 個復孔，分別作用8、20、32、44 h 后取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，每孔加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)清洗1次，再在每孔中加入0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.3)100 μL 和 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，搖勻，用酶標儀分別測定其540 nm波長處的光密度(D)。實驗重復3 次，取平均值計算細胞相對增殖率，細胞相對增殖率=[(D實驗組-D空白對照組)/(D陰性對照組-D空白對照組)]×100%[4]。

1.4 PNP比色法測定細胞堿性磷酸酶活性

經(jīng)10 ng/mL rhBMP-4 培養(yǎng)36 h 后出現(xiàn)肉眼可見的貼壁細胞時，將上清液移至EP管，以備后續(xù)實驗用，用PBS 緩沖液小心浸洗3 次，每孔加入100 μL 0.2%Triton X-100，于4 ℃下作用12 h，使細胞完全裂解，制成細胞裂解液。取30 μL 裂解液接種于另一96 孔培養(yǎng)板，空白對照孔用PBS 緩沖液取代rhBMP-4 細胞裂解液調(diào)零。按堿性磷酸酶測定試劑盒說明書加入同等比例緩沖液和基質(zhì)液，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，加顯色劑，使用酶標儀檢測D(405)值。實驗結(jié)果與對照比較，實驗重復3次，取平均值。

1.5 羥脯氨酸測定試劑盒檢測細胞羥脯氨酸含量

經(jīng)10 ng/mL rhBMP-4 培養(yǎng)36 h 后出現(xiàn)肉眼可見的貼壁細胞時，取50 μL 上清液移至EP 管，按羥脯氨酸測定試劑盒說明書逐步加入各試劑，使用酶標儀檢測D(570)值。實驗結(jié)果與對照比較，實驗重復3次，計算平均值。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 rhBMP-4對MG-63細胞增殖影響

與對照組比較，5、10、20 ng/mL 的rhBMP-4均能誘導MG-63 細胞的增殖(P<0.05)，且呈濃度依賴性(圖1A)；10 ng/mL rhBMP-4 組與 20 ng/mL rhBMP-4 組間對MG-63 細胞增殖影響的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在后續(xù)實驗中以10 ng/mL rhBMP-4 進行研究。進一步研究發(fā)現(xiàn)10 ng/mL rhBMP-4作用24 h后即可促進MG-63細胞增殖(P<0.05)，隨著時間的延長，其促增殖作用更加顯著，呈明顯的時間依賴性(圖1B)。

2.2 rhBMP-4 對MG-63 細胞堿性磷酸酶活性的影響

如圖2 所示，與對照組比較，10 ng/mL rhBMP-4增強了MG-63細胞的堿性磷酸酶活性(P<0.05)。

2.3 rhBMP-4 對MG-63 細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響

如圖3 所示，與對照組比較，10 ng/mL rhBMP-4可刺激MG-63細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白(P<0.05)。

圖1 rhBMP-4對MG-63細胞增殖影響

圖2 rhBMP-4對MG-63細胞堿性磷酸酶活性影響

圖3 rhBMP-4對MG-63細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的影響

3 討論

MTT 法是一種通過顏色反應來檢測細胞生長增殖和存活的方法[5]。其原理是活細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將MTT 還原為難溶性的藍紫結(jié)晶物甲臜，而甲臜生成量與細胞的增殖程度呈正相關，用酶標儀檢測D(540)，能間接反映活細胞的數(shù)量及活性。本研究用MTT 法檢測人成骨樣細胞的增殖能力，根據(jù)測定結(jié)果來看，10 ng/mL rhBMP-4能促進人成骨樣細胞MG-63的增殖。

堿性磷酸酶是成骨細胞的一種標志性外酶，從成骨組織中釋放出來而進入骨樣組織后發(fā)生鈣化[6]，是早期成骨的標志，它與牙周組織的改建密切相關。堿性磷酸酶活性越高，骨形成能力越強，骨基質(zhì)礦化越快，堿性磷酸酶的定量檢測可作為成骨細胞分化程度和功能狀態(tài)的評價指標。本研究發(fā)現(xiàn)，10 ng/mL rhBMP-4 能增強人成骨樣細胞MG-63的活性。

成骨細胞可分泌基質(zhì)蛋白，其中Ⅰ型膠原蛋白是其成骨階段分泌的主要礦化相關蛋白，是反映成骨的重要特異性指標[7]。羥脯氨酸是Ⅰ型膠原蛋白合成所必需的前體氨基酸，可作為衡量機體膠原含量的重要指標。rhBMP-4 是否影響人成骨樣細胞MG-63分泌Ⅰ型膠原可通過檢測培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量來驗證。本研究培養(yǎng)液中加入10 ng/mL rhBMP-4 后，羥脯氨酸的含量明顯提高，表明rhBMP-4 能促進成骨細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白，從而增進骨的形成與礦化。

綜上所述，本研究證實BMP-4 可誘導人成骨樣細胞MG-63的增殖與分化，為BMP-4誘導成骨細胞活性的臨床應用提供依據(jù)。