IL-37對氧化低密度脂蛋白誘導人冠狀動脈內皮細胞分泌單核細胞趨化蛋白1的影響

謝燕丹，黃曉君，胡烈敏，謝思田

(1.汕頭大學醫學院第一附屬醫院心血管內科，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院，廣東 汕頭 515041；3.汕頭大學醫學院第二附屬醫院燒傷整形外科，廣東 汕頭 515041)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病尤其是冠心病的主要病理基礎。AS是一種彌漫性、全身性血管慢性炎癥反應，可導致心、腦、腎等重要器官功能受損，其主要病理過程與炎癥反應密切相關。氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow density lipoprotein，ox-LDL)貫穿 AS 的發生和發展過程，損傷血管內皮功能，促進多種炎癥因子分泌，促使巨噬細胞逐漸轉化為泡沫細胞，吞噬脂質，形成脂質斑塊[1-2]。在ox-LDL促分泌的眾多炎癥因子中，趨化因子是一大類可以被誘導的促炎癥細胞因子。單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是趨化因子中的一員。MCP-1 與趨化因子受體結合后，趨化和激活單核細胞以及其他免疫細胞，促進炎癥反應[3-4]。

目前，炎癥反應在AS起始、進展，以及斑塊的破裂、血栓形成等全過程中所起的關鍵性作用已獲得廣泛共識。因此，恢復抗炎平衡可能有助于穩定AS 進展，甚至逆轉AS 進程。越來越多的證據表明，白細胞介素37(interleukin-37，IL-37)可顯著改變促炎性細胞因子的表達，從而減弱動脈粥樣硬化斑塊的形成[5]。故本研究探討IL-37對ox-LDL 誘導人冠狀動脈內皮細胞(human coronary artery endothelial cells, HCAECs)分泌 MCP-1 的影響，為臨床應用IL-37治療AS提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HCAECs 及其培養基、牛血漿纖連蛋白、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、內皮細胞因子等購自美國ScienCell 公司，ox-LDL、二甲基亞砜、MTT購自美國 Sigma 公司，siIL-37 mRNA 及 IL-37b 過表達質粒購自上海吉瑪基因公司，TRIzol、Lipofectamine?3000 Reagent、Opti-Men 等購自美國Life Technologies 公司，PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTM及柱式法 Total RNA 提取試劑盒購自日本Takara 公司，MCP-1 ELISA 試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養按HCAECs 培養說明書操作要求，將25 cm2培養瓶表面按2 μg/cm2預處理牛血漿纖連蛋白，放置于培養箱中過夜備用。將HCAECs 自液氮罐中取出，快速置于37 ℃恒溫水浴箱中，融化后種植到培養瓶中。當細胞密度為5 000/cm2時，置37 ℃，體積分數為5%的CO2培養箱中培養，次日換液，此后隔2 d換液1次，細胞融合達70%時，隔1 d 換液1 次，至細胞融合達90%時進行細胞傳代。選取第5代細胞進行相關實驗操作。

1.2.2 細胞轉染及實驗分組第5代HCAECs接種于24 孔板上，細胞密度為4×104/孔，以內皮細胞完全培養基培養，次日細胞融合達80%～90%時按Lipofectamine?3000 Reagent 說 明書進 行 轉染 操作。HCAECs 經 siIL-37 mRNA 或 IL-37b 過表達質粒轉染 24 h 后，再用 80 μg/mL ox-LDL 處理 24 h，同時設置空白對照組、未轉染ox-LDL 處理組、siRNA 陰性對照組、空白質粒組。除空白對照組外，其余各組均用80 μg/mL ox-LDL處理。IL-37b過表達質粒每孔用量為500 ng，siIL-37 mRNA 每孔終濃度為40 nmol/L。

1.2.3 MTT法檢測細胞的增殖各組細胞消化后制成細胞混懸液，調整細胞密度為1×105/mL，每孔加入100 μL細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，放于培養箱中培養，分別培養2、24 h后，每孔加入20 μL 0.5% MTT 溶液，繼續培養4 h 后終止培養，吸去孔內的培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，于搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解，用Multiskan Ascert 酶聯免疫檢測儀(賽默飛世爾科技公司)測量各孔490 nm 的光密度(D)。同時設置調零孔(MTT、培養基、二甲基亞砜)和對照孔(細胞、MTT、培養基、二甲基亞砜)。比較各組細胞增殖情況。

1.2.4 MCP-1 mRNA 表達的檢測RT-PCR 法檢測各組細胞MCP-1 mRNA 的表達。操作步驟按Takara 公司的實時熒光定量反轉錄試劑盒的說明書進行：37 ℃ 15 min(反轉錄反應)，85 ℃ 5 s(反轉錄酶失活反應)。采用兩步法PCR反應程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸及退火30 s，共40 個循環。于每個循環的延伸階段采集熒光信號。反應結束后做95 ℃的熔解曲線分析。每個樣品設3 個復孔，MCP-1 mRNA 的相對表達量用 2-ΔCT×1 000表示。MCP-1基因上游引物：5′-CATAGCAGCCACCTTCATTCC-3′；MCP-1基因下游 引 物 ： 5′-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTGG-3′。GAPDH上游引物：5′-CTGGGAGGAGAAGAT GC；GAPDH下游引物：ACCTTTGTTCCACGACC CATAG-3′。

1.2.5 MCP-1 蛋白表達的測定ELISA 法檢測各組細胞培養液上清中MCP-1蛋白水平。具體步驟參照試劑盒說明書：配置標準品并繪制標準曲線；設置空白孔，分別將樣品及不同濃度標準品加入相應孔中(100 μL/孔)；用封板膜封住反應孔，室溫孵育120 min；洗板5 次，拍干；加入生物素化抗體，100 μL/孔，室溫孵育60 min；洗板5 次， 拍干。 加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin，100 μL/孔，室溫避光孵育 20 min；洗板5 次，拍干；加入顯色劑TMB 溶液，100 μL/孔，室溫避光孵育15 min；加入終止液50 μL/孔，混勻后立即測量D(450)值。

1.3 統計學分析

應用SPSS 21.0統計軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較

各組細胞培養24 h 后，細胞的增殖能力的差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組細胞培養24 h后的增殖能力比較 (±s)

表1 各組細胞培養24 h后的增殖能力比較 (±s)

組別空白對照組未轉染ox-LDL處理組siIL-37 mRNA組siRNA陰性對照組IL-37b過表達質粒組空白質粒組D(490)0.417±0.011 0.395±0.005 0.404±0.005 0.404±0.006 0.403±0.003 0.411±0.007

2.2 各組細胞MCP-1 mRNA的表達

未轉染ox-LDL 處理組細胞內MCP-1 mRNA的表達與對照組相比增加(P<0.05)。siIL-37 mRNA組的MCP-1 mRNA 與siRNA 陰性對照組相比增加(P<0.01)。IL-37b 過表達質粒組的MCP-1 mRNA與空白質粒組相比減少(P<0.05)。見圖1。

2.3 各組細胞培養液上清中MCP-1蛋白的水平

未轉染ox-LDL 處理組細胞培養液上清中的MCP-1 蛋白的分泌量與對照組相比有增加(P<0.05)。siIL-37 mRNA 組的 MCP-1 蛋白分泌量較siRNA 陰性對照組增加(P<0.01)。IL-37b 過表達質粒組的MCP-1 蛋白分泌量較空白質粒組減少(P<0.05)。見圖2。

圖1 各組細胞MCP-1 mRNA的表達

圖2 各組細胞培養液上清中MCP-1蛋白的水平

3 討論

IL-37屬于白細胞介素1家族成員，已被證實為固有炎癥和免疫應答的一種天然抑制因子[6]，具有抗炎和免疫抑制作用，是一種炎癥負性調控因子[7]。Ji等[8-10]研究發現，在AS斑塊及AS患者的血液循環中，IL-37水平均升高。外源性IL-37可抑制DC細胞的成熟并誘導T調節細胞反應，從而減輕ApoE?/?小鼠的AS癥狀。Liu等[11]研究發現IL-37轉基因ApoE?/?小鼠及ApoE?/?小鼠，發現內源性IL-37能夠抑制ApoE?/?小鼠T調節細胞相關炎性因子的表達，如下調了TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12β和IFN-γ等的表達水平，IL-37能夠抑制DC細胞在體內及體外的浸潤和活化，IL-37發揮抗炎作用的機制為IL-37 抑制DC 細胞經IL-1R8-TLR4-NF-κB通路獲得活化功能，在AS模型ApoE?/?小鼠體內，可觀察到AS 斑塊的縮小。McCurdy 等[12]的研究發現，IL-37 能促使巨噬細胞由炎性特性的M1 亞型轉為具有抗炎特性的M2 亞型，從而發揮IL-37在AS過程中的抗炎作用。本研究發現，ox-LDL刺激正常狀態HCAECs，細胞培養上清可檢測到MCP-1 蛋白的分泌量增加，RT-PCR 檢測也發現MCP-1 mRNA 的增加，提示ox-LDL 能夠促使HCAECs 發生炎性反應。在本研究中，IL-37b 過表達質粒組細胞內MCP-1 mRNA 合成減少，細胞培養上清液中MCP-1 蛋白水平也下降。而應用siRNA 技術，內皮細胞IL-37基因沉默后，受到ox-LDL刺激后內皮細胞MCP-1 mRNA和蛋白水平均較siRNA陰性對照組增加。這提示IL-37作為抗炎癥因子可以下調HCAECs 經ox-LDL 刺激后MCP-1的表達。

綜上所述，本研究發現IL-37 對ox-LDL 誘導HCAECs分泌MCP-1有抑制作用。針對ox-LDL參與的AS，IL-37 拮抗炎性反應有可能成為臨床治療的關鍵措施。