ITS2和psbA-trnH序列對海灘牽牛的分子鑒定研究

黃琛斐，陳一村

(1.潮州市人民醫院中藥房，廣東 潮州 521000；2.汕頭大學醫學院藥理研究室，廣東 汕頭 515000)

海灘牽牛(Ipomoea stolonifera)是旋花科牽牛屬植物假厚藤的全草，又名白花馬鞍藤、小號馬鞍藤，主要分布于臺灣、福建、廣東等沿海地區的高潮線上的沙灘或沙丘[1-2]。海灘牽牛是潮汕地區治療風濕、類風濕關節炎的習用中藥材[3]，由于暫未作為藥材收錄于藥典中，該藥材暫無統一的質量標準，且市場上藥材多經過修治，從植物形態進行鑒別存在困難，僅能根據傳統的經驗進行鑒別，存在一定的誤差，因此深化海灘牽牛的分子鑒定研究對臨床用藥安全以及規范商品市場具有深刻意義。

目前海灘牽牛的研究多關于抗炎方面的研究[4-6]，暫無DNA 條形碼等相關的檢測技術報道。常用的 DNA 條形碼有 ITS、ITS2、psbA-trnH 及matK 等。其中，ITS2 序列是去除5.8S rRNA 序列和28S rRNA 序列的核糖體DNA 序列間隔區，psbA-trnH 片段是葉綠體DNA 的轉錄非編碼序列，位于psbA基因和trnH基因之間。ITS2、psbA-trnH 等這些非編碼區相對于編碼基因在功能上的限制較少，變異程度較高，能提供較多的系統發育信息，且容易擴增和測序，現已被廣泛應用于中藥材的分子鑒定[7]。本研究運用ITS2 和psbA-trnH兩個DNA條形碼對11份海灘牽牛藥材進行鑒定，并比較這兩個序列的對海灘牽牛的鑒定能力，為海灘牽牛的質量標準研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品從廣東潮州、揭陽、汕頭、汕尾，福建南靖、莆田等地收集的海灘牽牛樣品共11份，其中收集自福建南靖的8 號樣本經汕頭市中心醫院藥劑科羅梓河主任基源鑒定為海灘牽牛，作為本次實驗對照組。通過BLAST 從GenBank 下載相似度高的同屬植物厚藤(Ipomoea pes-caprae)的ITS2 序列和 psbA-trnH 序列各 2 條，甘薯(Ipomoea argillicola)的 psbA-trnH 序列 1 條，11 份海灘牽牛藥材樣品產地見表1。

1.1.2 主要試劑和儀器廣譜性植物DNA 提取試劑盒(廣州美基生物科技公司)，ITS2、psbA-trnH序列正、反向引物由深圳華大基因科技有限公司合成，1 000×GeneGreen核酸染料(北京天根生化科技公司)，瓊脂糖(BIOWEST，西班牙)，50×TAE緩沖液(上海索寶生物科技，中國)，500 克搖擺式高速萬能粉碎機(浙江屹立工貿公司)，小型臺式高速離心機(德國 Eppendorf 公司)，Veriti96 PCR 儀(美國ABI公司)，迷你核酸水平電泳儀(北京六一生物科技公司)，凝膠成像分析儀(上海天能科技公司)。

表1 海灘牽牛樣品信息

1.2 方法

1.2.1 海灘牽牛樣品DNA提取將海灘牽牛藥材進行粉碎處理，過4號篩后精密稱取30 mg藥材粉末于2 mL的離心管中，按植物DNA提取試劑盒的操作步驟提取海灘牽牛DNA。DNA于-20°C保存。

1.2.2 ITS2 和psbA-trnH 序列擴增及測序ITS2序列正向引物為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH 序列正向引物為 5′-GTTATGCAT GAACGTAATGCTC-3′，反向引物為 5′- CGCGCA TGGTGGATTCACAATCC-3′。PCR 反應體系：2×Taq PCRMix 酶 12.5 μL，正反向引物(2.5 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超純水10.5 μL，總體積為 25 μL。ITS2 序列擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 個循環；72 ℃延伸 10 min。psbA-trnH序列擴增程序：94 °C 預變性5 min；94 °C 變性1 min；55°C退火1 min，72°C延伸1.5 min；30個循環；72°C 延伸7 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將顯示清晰且單一的電泳條帶對應的PCR擴增產物送深圳華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 數據處理及分析使用BLAST 對測序結果進行比對，下載其中相似度高的序列作為后續分析數據。采用CodonCode Aligner V6.0.2 軟件對ITS2、psbA-trnH 序列的測序峰圖進行校對分析，除去低質量區，以MEGA 6.0 軟件對所有的DNA條形碼的序列進行分析比對，計算各序列的核酸組成以及K2P 遺傳距離，構建鄰接(neighbor-joining，NJ)進化樹，以1 000次重復的步長設置檢驗各分支的支持率。

2 結果

2.1 序列分析

11份海灘牽牛樣品ITS2引物的PCR擴增和測序成功率皆為100%，擴增特異性強，條帶單一且清晰(圖1)。ITS2 序列長度為349 bp，GC平均含量為60.2%，差異位點共48個(圖2)，其中1～7號樣品的差異位點一致，共23個；8～11號樣品差異位點一致，共25 個。psbA-trnH 序列擴增結果見圖3，僅有1、3、4、8號樣品顯示清晰條帶，PCR擴增成功率為36.4%；成功擴增并測序的僅有3和4號樣品，測序成功率為18.2%，GC平均含量為13.9%。

圖1 海灘牽牛樣品ITS2序列擴增

圖2 海灘牽牛樣品ITS2序列引物差異位點圖

圖3 海灘牽牛樣品psbA-trnH序列擴增

2.2 遺傳距離分析

通過對ITS2 區遺傳距離的分析，發現海灘牽牛1～7號樣品為1個種屬，相互間的K2P遺傳距離為 0.00，8～11 號樣品為 1 個種屬，相互間 K2P 遺傳距離為 0.00，1～7 號樣品與 8～11 號樣品的種間遺傳距離為0.13；同屬植物厚藤的種間距離為0.01，與海灘牽牛11 個樣品的種間遺傳距離為0.34～0.55。種內遺傳距離遠小于種間遺傳距離，即ITS2 序列能夠區分海灘牽牛和厚藤。通過對psbA-trnH 區遺傳距離的分析，發現海灘牽牛3～4號樣品種內遺傳距離為0.00，厚藤種內距離為0.78，種間距離為0.21～0.98，甘薯與厚藤2的種間遺傳距離為0.00，即psbA-trnH序列無法把不同種的厚藤與甘薯區分開。

2.3 NJ樹聚類分析

基于ITS2序列構建的NJ樹(圖4A)表明，不同來源的海灘牽牛樣品聚為一支，能夠跟同為牽牛屬的植物(厚藤)區分開來。基于psbA-trnH 序列構建的 NJ 樹(圖4B)表明，海灘牽牛 3～4 號樣品能夠聚為一支，但厚藤的兩個樣品無法聚為一支，而是和不同種屬植物(甘薯)聚為一支。

圖4 基于不同序列構建的海灘牽牛、厚藤和甘薯的NJ樹

3 討論

本研究從7 個不同城市進行收集的11 份海灘牽牛實驗樣品，通過植物DNA 提取試劑盒提取總DNA，其ITS2 序列的PCR 產物測序成功率達100%，說明ITS2序列對于海灘牽牛的鑒定穩定性高，是有效鑒定海灘牽牛的DNA區段。

由于海灘牽牛目前在GenBank 上暫無相關的序列片段，因此僅從GenBank 上下載相似度高的同屬植物(厚藤和甘薯)的ITS2和psbA-trnH序列共5條，與海灘牽牛樣品進行比對。通過最小遺傳距離法和基于ITS2 和psbA-trnH 序列構建的NJ 樹都能區分海灘牽牛和其他種屬的植物，但是psbA-trnH 序列無法明確分析牽牛屬植物系統發育關系，而且psbA-trnH 序列在海灘牽牛中擴增和測序比較困難。本研究海灘牽牛1、8 號樣品的psbA-trnH序列測序結果顯示樣本濃度低，加量測序仍無法成功測序。對樣品DNA 提取進行了3 次重復實驗，并對PCR反應體系進行多次調整(主要是調整模板DNA 含量)，實驗結果與前期結果相同。其原因可能是受藥材的加工步驟、儲存環境和儲存時間的影響，導致了樣品中的DNA 存在不同程度的降解。同時，psbA-trnH 序列GC 含量過低也可能是該序列測序成功率低的原因。

綜上所述，本研究發現ITS2 序列能有效鑒定海灘牽牛及同屬植物，而psbA-trnH 序列不適合作為海灘牽牛的DNA條形碼技術鑒定序列。