青錢柳愈傷組織的離體保存*

馮 瑩 林慶良 潘東明

(1. 泉州師范學院資源與環境學院 泉州 362000； 2. 福建農林大學 福州 350002)

離體保存自1975年由Henshaw和Morel首次提出后，以其占用空間小、無菌培養、人工和經費少、易于交流等優點(Villalobosetal.， 1995； Rayetal.， 2010； Engelmann， 2011； Vasanthetal.， 2011)，現已被應用于多種植物種質資源的離體保存，如： 半夏(Pinelliaternata)(劉修樹等， 2018)、地楓皮(Illiciumdifengpi)(張樂等， 2015)、木薯(Manihotesculenta)(黎萍等， 2015)、菊花(Chrysanthemummorifolium)(王小樂等， 2019a； 2019b)。通過在培養基內添加生長抑制劑(劉連軍等， 2016)、調節滲透壓(Panetal.， 2014； Renzendeetal.， 2018； Nasiruddinetal.， 2018)等方法限制培養物生長，從而延長繼代時間，實現植物的離體保存。但是，由于遺傳變異的存在，保存材料及其與原先種苗的遺傳穩定性檢測也是十分必要的。目前，可通過細胞學、分子標記等方法檢測保存材料的遺傳穩定性。簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)是第二代分子標記技術，具有多樣性高、重復性好等優點，現也被廣泛地用于分析植物離體保存材料的遺傳穩定性。

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)屬于胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya)，是我國獨有的單種屬喬木植物，主要分布在江西、浙江、湖南、福建、四川等地山區(方升佐等， 2007)。現存的青錢柳以天然林為主，自然條件下，青錢柳繁殖能力弱，林下幼苗少(方升佐等， 2003)，且隨著其藥用價值的發掘，青錢柳天然林受到嚴重破壞。故而，青錢柳種質資源的保存就顯得十分必要。

愈傷組織是適宜的離體保存材料。近年來，研究者們主要針對愈傷組織誘導與分化、易褐化等問題開展青錢柳離體培養的研究，初步建立了良好的愈傷組織誘導、分化體系(Huetal.， 2010； 謝寅峰等， 2011； 阮氏釧等， 2014； 吳玲利等， 2019)，并有效解決了愈傷組織褐化問題(馮瑩等， 2019)，但關于青錢柳愈傷組織離體保存的研究尚未見報道。

本文以青錢柳愈傷組織為離體保存材料，在優化植物激素的基礎上，通過添加滲透調節劑和生長抑制劑，探索出青錢柳愈傷組織離體保存的方法，并結合流式細胞術和SSR分子標記技術檢測愈傷組織的遺傳穩定性，以期為青錢柳種質資源的長期離體保存提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為青錢柳愈傷組織，該類愈傷組織呈黃綠色或綠色、顆粒小、表面干爽，是由葉片(來自福建永春種源)誘導的。

1.2 愈傷組織離體保存試驗

挑取新鮮且生長一致的愈傷組織，培養于保存培養基(除特殊說明外，保存培養基組成為： 改良MS基本培養基、0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA、30 g·L-1蔗糖、6.0 g·L-1瓊脂粉，pH5.8)。每瓶接種0.5 g愈傷組織(共4團)，每10瓶為一個組合，重復3次。稱取不同保存時間段內愈傷組織的鮮質量，統計增殖倍數和死亡率，并觀察生長狀態。

采用日光燈為培養光源，培養條件為光照強度283.02 μmol·m-2s-1，光照時間為每天12 h，培養溫度為(20±1)℃。

1.2.1 6-BA+IBA組合對愈傷組織離體保存的影響 采用二因素完全隨機試驗法，試驗了保存培養基中6-BA+IBA濃度組合(6-BA濃度為0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1； IBA濃度為0.2、0.4 mg·L-1)對愈傷組織離體保存的影響。

①優：腰痛、腿痛均消失，腰部運動無限制，可正常生活及工作。②良：腰痛、腿痛顯著改善，腰部運動無限制，可進行輕微的工作。③可：腰痛、腿痛有所好轉，但不能獨立活動及工作。④差：腰痛、腿痛、運動功能等無改善，或加重。

1.2.2 蔗糖濃度和保存時間對愈傷組織離體保存的影響 采用單因素完全隨機試驗方法，針對保存培養基中添加不同蔗糖濃度(30、45、50、55、60 g·L-1)進行愈傷組織離體保存試驗。針對保存培養基內添加不同蔗糖濃度(30、45、50、55 g·L-1)，進一步比較不同保存時間(60、90、120、150、180 天)對愈傷組織離體保存的影響。

1.2.3 滲透調節劑對愈傷組織離體保存的影響 采用單因素完全隨機試驗方法，針對保存培養基中添加不同種類和濃度的滲透劑(甘露醇： 0、10、20、30、40、50 g·L-1； 肌醇： 0、10、20、30、40、50 g·L-1)進行愈傷組織離體保存試驗。

1.2.4 生長抑制劑對愈傷組織離體保存的影響 采用單因素完全隨機試驗方法，針對保存培養基內添加不同種類和濃度的生長抑制劑(多效唑(PP333)： 0、2、4、6、8、10 mg·L-1； 丁酰肼(B9)： 0、2、4、6、8、10 mg·L-1)進行愈傷組織的離體保存試驗。

1.3 離體保存的愈傷組織恢復生長和遺傳穩定性

將黃綠色、顆粒狀且顆粒小而疏松的愈傷組織(Ⅱ類型愈傷組織，離體保存培養基中培養)在改良MS+0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+45 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂粉(pH5.8)離體保存培養基內進行離體保存，繼代保存周期為90天，每繼代1次記為一代。隨機挑取不同保存代數的愈傷組織(增殖培養的愈傷組織T0、保存第1、3、5、7、9、11、13、15代的愈傷組織T1、T3、T5、T7、T9、T11、T13、T15)，分別進行細胞倍性分析和遺傳穩定性分析。

1.3.1 恢復生長 取保存第15代的部分Ⅱ類愈傷組織重新接入增殖培養基(改良MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂粉，pH5.8)和分化培養基(待發表，成分包括改良MS+6-BA+IAA+蔗糖+瓊脂粉，pH5.8)，進行恢復生長培養。

1.3.2 細胞倍性分析 以葉片(來源于福建永春種源)為對照(CK)，采用流式細胞術法檢測不同保存代數的愈傷組織(T1、T3、T7、T11、T15)細胞的倍性。采用Partec CyStain UV Precise P試劑盒提取愈傷組織DNA后，于流式細胞儀檢測細胞倍性。

1.3.3 SSR分子標記技術檢測遺傳穩定性 采用CTAB法，分別提取葉片(對照，來源于福建永春種源)和不同保存代數的愈傷組織(T0、T1、T3、T5、T7、T9、T11、T13、T15)DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的完整性。參照Fan等(2013)的方法，篩選出4對引物，引物序列分別為： F1-F： 5′-ATTCCCC ACCCCCATCTC-3′，F1-R： 5′-CTCCTCCAGCGCAC ATAA-3′； F2-F： 5′-AGATGGCTTTTCAGATTTG-3′，F2-R： 5′-CGGAAACTTGAATCAGAG-3′； F3-F： 5′-CTGGCACGCACAATACAC-3′，F3-R： 5′-CCAAAAA GGGTTGAGCTT-3′； F4-F： 5′-TCCTCCACTTCCAATG AT-3′，F4-R： 5′-AGAGGAGCAAACAAACAT-3′。

采用SSR分子標記技術分析不同保存代數愈傷組織的遺傳穩定性。以DNA為模板進行SSR-PCR擴增。PCR擴增產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，經銀染后拍照觀察。

1.4 數據統計與分析

增殖倍數=轉接的愈傷組織總瓶數/原培養的愈傷組織總瓶數； 愈傷組織的死亡率(%)=死亡的愈傷組織總團數/原愈傷組織總團數×100%； 愈傷組織凈增長量(g)=60天愈傷組織鮮質量-0.5。

2 結果與分析

2.1 不同處理對愈傷組織離體保存的影響

2.1.1 離體保存的愈傷組織生長情況 觀察愈傷組織在離體保存培養基的生長情況表明： 在保存60天內，隨著培養時間的延長，愈傷組織在各類離體保存培養基內均可以繁殖(表1)，表現為不同的質地： Ⅰ類愈傷組織呈粉紅色或紅色，粉末狀或顆粒狀，質地疏松(圖1A、B)； Ⅱ類愈傷組織呈黃綠色，顆粒狀，顆粒小而疏松(圖1C、D)； Ⅲ類愈傷組織呈米白色，團塊狀或粉末狀，質地疏松(圖1E、F)。

表1 愈傷組織在離體保存培養基內的質地表現Tab.1 The growth of callus cultured in the different conservation medium

圖1 愈傷組織保存類型Fig.1 The type of callus in vitro conservation in C. paliurusA, B: I類型愈傷組織; C, D: II類型愈傷組織; E, F: III類型愈傷組織。 A, B: Type Ⅰcallus; C, D: Type Ⅱcallus; E, F: Type Ⅲcallus.

2.1.2 6-BA+IBA濃度組合對愈傷組織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時，添加0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA組合效果較好，愈傷組織死亡率為0，且生長較為緩慢，增殖倍數為3.52倍，與同為零死亡的0.6 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA組合達到顯著性差異(表2)。當保存90天時，愈傷組織的死亡率均達到50%以上。

表2 6-BA+IBA對青錢柳愈傷組織離體保存的影響①Tab.2 The effect of 6-BA and IBA on in vitro callus conservation in C. paliurus

2.1.3 不同蔗糖濃度及其保存時間對愈傷組織離體保存的影響 試驗結果(圖2)表明： 保存60天時，與添加30 g·L-1蔗糖(對照組)相比，添加45～55 g·L-1蔗糖可有效地抑制愈傷組織生長，其鮮質量凈增長量和增殖倍數逐漸降低，與對照組達到顯著性差異，死亡率為0； 當蔗糖濃度為60 g·L-1時，愈傷組織鮮質量凈增長量和增殖倍數為最低，但死亡率達到22.22%。

圖2 不同蔗糖濃度對青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.2 The effect of different sugar content on in vitro callus conservation in C. paliurus

進一步針對不同保存時間對愈傷組織離體保存影響的試驗結果(表3)表明： 與添加30 g·L-1蔗糖(對照組)相比，添加45～55 g·L-1蔗糖保存60 天時，愈傷組織存活率均達到100%； 隨保存時間的延長和蔗糖濃度升高，愈傷組織存活率逐漸降低。添加45 g·L-1蔗糖保存90 天時，愈傷組織存活率100%，與其他處理差異顯著，愈傷組織質地為Ⅱ類型。

表3 不同保存時間對青錢柳愈傷組織離體保存的影響
Tab.3 The effect of different days oninvitrocallus conservation inC.paliurus

蔗糖濃度Sugar content/(g·L-1)存活率Survival rate(%)60 d90 d120 d150 d180 d30 100±0 a79.33±3.06 c24.00±4.00 d0±0 d0±0 b45 100±0 a100±0 a74.67±3.06 a38.00±4.00 a14.00±6.00 a50100±0 a88.67±3.06 b57.33±6.11 b26.67±3.06 b0±0 b55100±0 a68.00±3.00 d40.00±2.00 c14.00±4.00 c0±0 b

2.1.4 甘露醇對愈傷組織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時，與添加0 g·L-1甘露醇(對照組)相比，添加10～50 g·L-1甘露醇保存的愈傷組織生長緩慢，其鮮質量凈增長量和增殖倍數呈顯著性降低(圖3A)，死亡率逐漸升高(圖3B)。當保存90天時，10 g·L-1甘露醇保存的愈傷組織存活率為66.67%，其余濃度保存的愈傷組織死亡率均達到90.00%以上。

2.1.5 肌醇對愈傷組織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時，與添加0 g·L-1肌醇(對照組)相比，添加10～50 g·L-1肌醇保存的愈傷組織鮮質量凈增長量和增殖倍數均先升高后降低(圖4 A)，但死亡率逐漸升高(圖4B)； 當保存90天時，愈傷組織死亡率均達到100%。

圖3 不同甘露醇濃度對青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.3 The effect of mannitol content on in vitro callus conservation in C. paliurus

圖4 不同肌醇濃度對青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.4 The effect of inositol content on in vitro callus conservation in C. paliurus

2.1.6 多效唑對愈傷組織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時，與添加0 mg·L-1多效唑(對照組)相比，添加2～10 mg·L-1多效唑保存的愈傷組織鮮質量凈增長量和增殖倍數顯著降低(圖5A)，但死亡率逐漸升高(圖5B)； 保存90天時，愈傷組織死亡率均達100%。

2.1.7 丁酰肼對愈傷組織離體保存的影響 青錢柳愈傷組織離體保存60天時，與添加0 mg·L-1丁酰肼(對照組)相比，添加2～10 mg·L-1丁酰肼可有效地抑制愈傷組織生長，愈傷組織鮮質量凈增長量和增殖倍數先升高后降低(圖6A)，但死亡率逐漸升高(圖6B)； 當保存90天時，愈傷組織死亡率均達到100%。

圖5 不同多效唑濃度對青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.5 The effect of PP333 on in vitro callus conservation in C. paliurus

圖6 不同丁酰肼濃度對青錢柳愈傷組織離體保存的影響Fig.6 The effect of B9 content on in vitro callus conservation in C. paliurus

綜合蔗糖處理、滲透調節劑處理和生長抑制劑處理的結果表明： 適宜于愈傷組織的離體保存培養基為改良MS+0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+45 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂粉，pH5.8，適宜的繼代保存周期為90天，愈傷組織質地為II類型。

2.2 離體保存的愈傷組織遺傳穩定性分析

2.2.1 恢復生長培養 恢復生長培養40天觀察發現： 愈傷組織均能恢復生長，與T0在形態、生活力和生長勢上沒有差異(圖7A、B)，并能夠分化(圖7C、D)。

2.2.2 不同保存代數愈傷組織細胞倍性的分析 對不同保存代數的愈傷組織細胞倍性檢測結果表明： 與對照(葉片)相比，不同保存代數的愈傷組織細胞倍性沒有發生改變(圖8)，沒有發生遺傳性變異。

圖7 青錢柳愈傷組織恢復生長Fig.7 Recovery growth of callus in vitro conservationA: T0代愈傷組織(對照); B: 保存15代后恢復生長的愈傷組織; C, D: 恢復生長的愈傷組織分化。A: Callus growth of T0 (control); B: Recovery growth of callus in vitro conservation (T15); C, D: Differentiation of callus after recovery growth.

圖8 不同保存代數愈傷組織的細胞倍性檢測Fig.8 Analysis of cell ploidy of different conservation time of callus in vitro conservationA: 葉片的細胞倍性(對照); B-F: 分別為保存第1、3、7、11、15代愈傷組織的細胞倍性; FL4: 熒光強度。A: Cell ploidy of leaf (CK); B-F: Cell ploidy of callus in vitro conservation(T1, T3, T7, T11, T15); FL4: Fluorescence intensity.

2.2.3 SSR分子標記技術檢測不同保存代數愈傷組織的遺傳穩定性 與葉片(對照)相比，不同保存代數的愈傷組織擴增圖譜沒有產生特異性條帶(圖9)。這說明保存材料穩定性好，沒有發生遺傳變異。

3 討論

利用培養基的高滲透壓抑制離體保存材料的生長，是植物離體保存的方法之一。通過添加蔗糖和甘露醇等滲透調節劑來提高培養基的滲透壓，可抑制培養材料對水分和營養物質的吸收(Holobiuc, 2015； Thakuretal., 2015； Gomesetal., 2017； Vettorazzietal., 2017)，從而起到抑制離體材料的生長，實現離體保存的目的。本試驗發現，保存培養基中添加適量的蔗糖(45～55 g·L-1)能有效地抑制愈傷組織的生長，但蔗糖(30 g·L-1)和甘露醇(≥10 g·L-1)組合、高濃度蔗糖(≥60 g·L-1)隨著保存時間的延長均會導致青錢柳愈傷組織的死亡率增加。這同黎萍等(2015)、劉修樹等(2018)、Muňoz等(2019)、王小樂等(2019a)、Pan等(2014)的研究結果一致。Nasiruddin等(2018)指出甘露醇和蔗糖組合有利于馬鈴薯(Solanumtuberosum)的離體保存，與本研究的結果不一致，這可能是由于不同植物離體保存的途徑不同(Duetal.， 2012)。

培養基中添加植物生長抑制劑(如： 多效唑、丁酰肼)以減緩培養物的生長可實現植物離體保存(黎萍等， 2015； 劉連軍等， 2016)。本試驗發現，多效唑和丁酰肼雖然能明顯地抑制愈傷組織的生長，但保存時間較短(≤60天)，且隨著培養時間的延長，愈傷組織的死亡率增加，不適宜作為愈傷組織離體保存生長抑制劑。這同黎萍等(2015)、史芳芳(2015)的研究結果一致。但劉連軍等(2016)指出PP3331.0～1.5 mg·L-1、B90.5～1.0 mg·L-1可以有效地延長木薯(Manihotesculenta)試管苗保存時間，提高存活率，是對木薯種質資源離體保存方法之一。這可能是由于植物生長抑制劑對不同離體保存材料的延緩作用表現不同。

圖9 不同保存代數青錢柳愈傷組織的SSR分子標記Fig.9 Identification of in vitro callus conservation for different cultural time with SSR marker in C. paliurus1-11、12-22、23-33、34-44分別為F1、F2、F3、F4引物標記的SSR擴增產物； 每組樣品依次為葉片(來源于福建永春種源)、不同代數的愈傷組織(T0、T1、T3、T5、T7、T9)、葉片(來源于江西井岡山種源)、不同代數的愈傷組織(T11、T13、T15)。1-11, 12-22, 23-33 and 34-44 mean SSR products with leaf from FujianYongchun, callus in vitro conservation from T0, T1, T3, T5, T7 and T9, leaf from Jiangxi Jinggangshan, callus in vitro conservation from T11, T13 and T15 by F1, F2, F3, F4, respectively.

離體保存是植物優良種質資源保存的一種較好手段，但離體保存時必須時刻關注其離體保存材料的遺傳穩定性。本試驗采用SSR分子標記技術和流式細胞術對不同保存代數的青錢柳愈傷組織遺傳穩定性的檢測結果表明，不同保存代數愈傷組織均未發生變異，遺傳穩定性好。李曉艷等(2009)、白建明等(2010)、尹明華等(2015)、王小樂等(2019b)對越橘(Vacciniumspp.)、馬鈴薯、紅芽芋(Colocasiaesculentavar.cormosuscv. Hongyayu)、菊花離體保存有類似的結果。

4 結論

在青錢柳保存培養基中添加生長抑制劑多效唑和丁酰肼及滲透調節劑甘露醇和肌醇均能抑制青錢柳愈傷組織生長，但不利于青錢柳愈傷組織的離體保存； 適宜的青錢柳愈傷組織離體保存的培養基為改良MS基本培養基+0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+45 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1瓊脂粉，pH5.8，該培養基可有效地限制青錢柳愈傷組織生長； 在(20±1)℃下每隔90天轉接1次，是青錢柳愈傷組織離體保存繼代的最佳途徑。該途徑下離體保存的愈傷組織能恢復生長和分化，遺傳穩定性好，未發生變異。