宮頸癌患者外周血細胞中miRNA-216b 的表達水平及臨床意義

周艷齊，趙松蘭，沈亞杰，于紅風

鎮江市第一人民醫院婦產科，江蘇 鎮江2120000

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，容易蔓延或發生淋巴結轉移，導致患者預后不佳[1-2]。大量研究提示宮頸癌發病與病毒感染尤其是人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染密切相關，但是其發病機制尚未完全明確。近年來隨著分子生物學技術的飛速發展，研究發現宮頸癌的發生發展還涉及多基因的異常調控[3-6]。因此，尋找能夠早期診斷和判斷宮頸癌預后的分子標志物，有助于深入挖掘宮頸癌的發病機制，為宮頸癌的治療提供新靶點和新思路。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為18～22 個核苷酸的短鏈非編碼RNA，可以通過靶向識別信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'-非翻譯區（untranslated region，UTR），在轉錄后水平調控靶基因的表達[7]。越來越多的研究表明，miRNA參與了多種復雜的生物學過程，包括腫瘤的發生和進展，并且不同腫瘤具有不同的miRNA表達譜[8-10]。然而，關于miRNA-216b在宮頸癌發生發展中作用機制的臨床研究仍然較少。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測宮頸癌患者外周血細胞中miRNA-216b 的表達水平，旨在探討miRNA-216b 對宮頸癌診斷及預后判斷的作用，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2011 年7 月至2018 年7 月于鎮江市第一人民醫院就診的55 例宮頸癌患者。納入標準：經病理檢查確診為宮頸癌；初次診斷且未經過治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤；1 個月內有輸血史。55 例宮頸癌患者的年齡為37～76 歲，平均年齡為（57.43±7.34）歲；體重指數（body mass index，BMI）為19.53～27.05 kg/m2，平 均BMI 為（21.48±4.22）kg/m2。另選取同期進行體檢的健康者30 例作為對照，年齡為35～75 歲，平均年齡為（56.66±9.73）歲；BMI 為19.03～25.39 kg/m2，平 均BMI 為（20.95±4.08）kg/m2。宮頸癌患者和健康者的年齡、BMI 比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 外周血細胞RNA 提取及逆轉錄

收集宮頸癌患者和健康體檢者的外周血標本，其中宮頸癌患者的血標本采集于病理確診和治療前，1000 r/min 離心5 min 后去上清。將留取的外周血細胞通過Trizol 法提取總RNA，將RNA 置于冰上充分溶解45 min，采用Nanodrop 分光光度計檢測其濃度及純度，并將濃度全部標準化。采用miScript Reverse Transcription Kit（購自德國Qiagen公司）將上述標準化的RNA 逆轉錄成cDNA。反應體系配制完成后，按照說明書要求將其置于普通聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀中反應1 h。逆轉錄完成后，收集產物于4 ℃保存。將剩余的RNA 進行分裝后置于-80 ℃保存。

1.3 實時熒光定量PCR

采用實時熒光定量PCR檢測樣本中miRNA-216b的表達情況，檢測采用的試劑為miScript SYBR Green PCR Kit（購自德國Qiagen 公司）。每次實驗均設置陽性和陰性對照。miRNA-216b 上游引物為5'-AAATCTCTGCAGGCAAATGTGA-3'，下游引物為miScript SYBR Green PCR Kit 中的通用引物；U6 上游引物為5'-GTGCTCCCTGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，下游引物為5'-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3'。以U6 為 內 參，采用2-△△Ct法計算miRNA-216b 的相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0 軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗；不符合正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和曲線下面積（area under the curve，AUC）分析miRNA-216b 對宮頸癌的診斷效能。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗。以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者和健康者外周血細胞中miRNA-216b的表達情況

宮頸癌患者外周血細胞中miRNA-216b 的相對表達量為0.011（0.005，0.026），明顯低于健康者的0.109（0.047，0.255），差異有統計學意義（U=225.000，P﹤0.01）。ROC 曲線分析結果顯示，miRNA-216b 能夠鑒別診斷宮頸癌患者和健康者，其AUC 為0.865（95%CI：0.771～0.956，P﹤0.01），且其截斷值為0.017 時，診斷靈敏度和特異度分別為63.6%和93.3%（圖1）。

2.2 不同miRNA-216b 表達情況宮頸癌患者臨床特征的比較

基于miRNA-216b 相對表達量的截斷值0.017，將宮頸癌患者分為miRNA-216b 低表達組（n=35）和miRNA-216b 高表達組（n=20）。miRNA-216b 低表達組和高表達組患者的年齡、HPV 感染情況、病理分期、腫瘤直徑比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）；miRNA-216b 低表達組患者臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、術后復發的比例均高于miRNA-216b 高表達組患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同miRNA-216b 表達情況宮頸癌患者臨床特征的比較（n=55）

2.3 生存情況的比較

隨訪過程中，所有患者的總生存時間資料均收集完整，但7 例患者的無病生存時間信息無法獲取。miRNA-216b 高表達組患者的總生存情況優于miRNA-216b 低表達組，差異有統計學意義（χ2=5.704，P﹤0.05）；miRNA-216b 高表達組和低表達組患者的無病生存情況比較，差異無統計學意義（χ2=2.759，P﹥0.05）。（圖2、圖3）

圖2 miRNA-216b低表達組（n=35）和高表達組（n=20）宮頸癌患者的總生存曲線

3 討論

圖3 miRNA-216b低表達組（n=29）和高表達組（n=19）宮頸癌患者的無病生存曲線

近年來，越來越多的研究證實miRNA-216b 參與了多種惡性腫瘤的發生發展，包括結腸癌、肝癌、胰腺癌等[11-14]。Yang 等[15]通過生物信息學分析發現，miRNA-338 和miRNA-216b 可能是宮頸上皮內瘤變發生發展中的關鍵miRNA。He 等[16]研究發現，miRNA-216b 可以通過抑制增殖相關蛋白（如cyclin D1、c-myc、p21、p-Rb以及LEF1）的表達，從而抑制宮頸癌細胞的增殖。此研究發現，miRNA-216b可以通過結合FOXM1 基因的3'-UTR 抑制其表達，從而發揮抗腫瘤作用。此外，宮頸癌組織標本和細胞株中miRNA-216b 的表達水平均下調，且miRNA-216b 低表達往往提示宮頸癌患者預后不良。本研究結果顯示，宮頸癌患者外周血細胞中miRNA-216b 的相對表達量低于健康者，且miRNA-216b 對宮頸癌具有一定的診斷價值。由于外周血樣本容易獲得，因此外周血miRNA-216b 檢測可輔助診斷宮頸癌，具有潛在的臨床應用價值。

除了可以作為宮頸癌的診斷標志物，miRNA-216b表達水平還與宮頸癌患者的預后密切相關。本研究結果顯示，miRNA-216b 低表達組和高表達組患者的年齡、HPV 感染情況、病理分期、腫瘤直徑比較，差異均無統計學意義（P﹥0.05）；miRNA-216b低表達組患者臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、術后復發的比例均高于miRNA-216b 高表達組患者，差異均有統計學意義（P﹤0.05）。此外，生存分析結果顯示，miRNA-216b 高表達組患者的總生存情況優于miRNA-216b 低表達組，差異有統計學意義（P﹤0.05）；然而，miRNA-216b 高表達組和低表達組患者的無病生存情況比較，差異無統計學意義（P﹥0.05），可能與病例數較少等因素有關。He 等[16]研究發現，宮頸癌組織中miRNA-216b 的表達情況與臨床分期、總生存期及無病生存期密切相關。因此，可以初步判斷無論從腫瘤組織還是外周血層面，miRNA-216 表達水平都可以作為判斷宮頸癌患者預后的重要標志物。

綜上所述，宮頸癌患者外周血細胞中miRNA-216b 表達下調，其可以作為輔助診斷宮頸癌和判斷預后的重要標志物。