miRNA-9 對胃癌細胞增殖和遷移的作用研究

周建萍，余猛進，毛振彪

1解放軍海軍軍醫大學（第二軍醫大學）第一附屬醫院急診科，上海200433

2南通大學附屬醫院消化科，江蘇 南通2260010

胃癌是人類最常見的癌癥之一，2012 年胃癌新發病例近100 萬例，居全球常見惡性腫瘤第五位。70%以上的胃癌病例發生在發展中國家，其中一半發生在東亞（主要是中國）。胃癌是全球男性和女性因癌癥死亡的第三大死因，估測中國是世界上胃癌發病率和病死率最高的國家[1]。胃癌發病率隨年齡增長而增長顯著，發病高峰年齡為60～74 歲；然而，目前其在30 歲以下人群中越來越普遍。中國胃癌的發病率和病死率明顯高于其他國家，預后普遍較差。2015 年，中國年齡標化后的胃癌發病率和病死率在所有腫瘤中居第二位。人口增長和老齡化導致大量新發病例，幽門螺桿菌感染可能會導致胃癌發生[2]。近幾十年來，已報道大量的微小RNA（microRNA，miRNA）與胃癌有關。miRNA 主要通過抑制靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）翻譯或mRNA 降解參與腫瘤的發生發展[3]。最近的研究表明，miRNA可能作為潛在的致癌基因或抑癌基因在人類癌癥中發揮重要作用[4]。miRNA 是由18～24 個核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，結合在與之互補的mRNA 3'非編碼區（untranslated region，UTR）或5'UTR，與蛋白質因子形成RNA 沉默復合物，導致mRNA 降解或翻譯抑制，從而在轉錄后水平調節基因表達[5]。miRNA 調節細胞分化、增殖和凋亡，其異常表達促進細胞增殖，阻滯細胞周期，抑制細胞凋亡，誘導腫瘤血管生成[6]。真核生物miRNA 調節mRNA，大量證據表明人類癌癥中miRNA 突變或欠表達，提示miRNA可能為腫瘤致癌基因或抑癌基因[7]。本研究使用miRNA-9 轉染人胃癌細胞株，并分別采用CCK-8和Transwell 法檢測胃癌細胞的增殖和遷移能力。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞株MKN-45 購自中國科學院上海細胞庫；根據Geen Bank 提供的miRNA-9 序列，miRNA-9 質粒由上海吉瑪公司合成。CCK-8 試劑盒購自beyotime 公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM、RPM1640 培養基均購自Hyclone 公司；無內毒素的少量質粒抽提試劑盒購自Omega 公司；Lipofectamine 2000 試劑盒購自invitrogen 公司。

1.2 細胞培養及轉染

常規培養傳代，取傳代2、3 次且生長良好的對數生長期細胞，以5×106/ml 接種到6 孔培養板無抗完全培養基培養24 h。預實驗確定250 ml 無血清培養基稀釋4.0 mg DNA，8 ml Lipofectamine 2000稀釋250 ml無血清培養基，二者混合后總體積500 ml。將脂質體和DNA 混合物逐滴加入到每孔中，充分混勻。37 ℃5%CO2培養箱孵育6 h，更換培養基，MKN-45 細胞株加入混合物48 h，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.3 質粒抽提

重組質粒轉化，搖菌，質粒小量抽提，制備質粒的過程即裂解細菌、分離、收集、純化質粒的過程。先用強熱或酸、堿等化學物質破壞細胞壁，使細菌染色體DNA 變性并纏繞附著在細胞碎片上或被切斷成不同大小的線性片斷。外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA 片段難以復性，而質粒DNA 雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，溶解在液相中，再通過樹脂吸附等方法將其分離。使用無內毒素的少量質粒抽提試劑盒獲得，具體操作步驟按照說明書進行。

1.4 CCK-8 檢測細胞增殖

實驗分為4 組：miRNA-9 類似物組、miRNA-9抑制物組、陰性對照組、空白對照組（MKN-45 細胞加新鮮的DMEM培養基）。取MKN-45細胞株對數生長期細胞，調整細胞密度為5×105/ml 接種至6 孔板，次日長滿，分別將miRNA-9類似物、miRNA-9抑制物、陰性對照質粒按照Lipofectamine 2000 說明書轉染MKN-45 細胞株。12 h 后胰酶消化，調整細胞密度為2×103/ml 細胞懸液接種至96 孔板，無抗完全培養液定容至每孔100 ml，于37 ℃5%CO2培養箱培養。調零組為無抗完全培養液，每組設6 個復孔，分別在24、48、72 h 測定吸光度，測定前避光加CCK-8 每孔10 ml，37 ℃5%CO2培養2 h，終止培養，酶聯免疫檢測儀測定450 nm 波長下的吸光度，去掉極端值，實驗重復3 次，取均值。

1.5 Transwell 法檢測細胞遷移

制備細胞懸液，調整細胞密度1×105/ml。取MKN-45 細胞懸液200 ml 接種于Transwell 小室。24 孔板下室加入600 ml 含20%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的培養基，常規培養24 h。結果統計使用直接計數法，取出Transwell小室，棄去孔中培養液，用PBS 清洗2 遍，甲醇固定30 min，將小室適當風干，0.1%結晶紫染色固定20 min，棉簽輕輕擦掉小室上層未遷移細胞，PBS 清洗3遍。100 倍倒置顯微鏡下隨機選取5 個視野觀察細胞。實驗重復3 次，取均值。

1.6 統計學分析

采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用重復測量方差分析，以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-9 質粒轉染胃癌細胞株MKN-45 的效率測定

使 用Lipofectamine 2000 轉 染，轉 染48 h 后MKN-45 細胞株轉染效率達到90%（圖1），細胞損傷最低，轉染時間過久，易出現細胞凋亡。

圖1 陰性對照質粒轉染胃癌MKN-45細胞株（×100）

2.2 質粒檢測

質粒DNA 濃度和純度測定吸光度值A260∶A280=1.8～1.9，如高于此范圍，說明有殘余蛋白質存在，低于此范圍提示混有RNA。2%瓊脂糖凝膠電泳，質粒DNA 以3 種形式存在，即環狀DNA、線狀DNA、超螺旋DNA。miRNA-9 質粒分子量為5702 bp，質粒電泳說明提取質粒符合實驗要求。

2.3 miRNA-9 對MKN-45 細胞增殖的影響

轉染48、72 h 時計算細胞增殖率，miRNA-9 類似物組細胞增殖率分別為（60.233±4.366）%、（114.063±1.730）%，miRNA-9 抑制物組細胞增殖率分別為（22.216±5.583）%、（59.637±8.542）%。結果顯示miRNA-9 類似物組細胞增殖率高于陰性對照組和空白對照組（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同時間點各組MKN-45 細胞的增殖率（%±s）

表1 不同時間點各組MKN-45 細胞的增殖率（%±s）

組別miRNA-9類似物組miRNA-9抑制物組陰性對照組空白對照組轉染24 h 6.045±5.363 12.309±7.326 10.520±8.061 8.5678±6.735轉染48 h 60.233±4.366 22.216±5.583 25.742±7.835 40.756±7.876轉染72 h 114.063±1.730 59.637±8.542 72.764±15.698 90.333±14.395

2.4 miRNA-9 對MKN-45 細胞遷移的影響

分別計數轉染48 h 后各組穿過濾膜的細胞數，結果顯示miRNA-9 類似物組穿膜細胞數為（1052±71）個，miRNA-9 抑制物組為（276±32）個，陰性對照組為（595±42）個，空白對照組為（613±35）個，miRNA-9 類似物組穿膜細胞數較空白對照組、陰性對照組增多。（圖2）

圖2 Transwell遷移實驗觀察各組MKN-45細胞的遷移能力（結晶紫染色，×100）

3 討論

癌癥是由致癌基因、抑癌基因和miRNA 改變而引起的[8]。腫瘤相關基因的異常調節、基因增加或缺失、異常的蛋白質翻譯導致致癌基因過表達和抑癌基因下調[9]。miRNA 的異常表達促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，誘導腫瘤血管生成；miRNA存在于不同腫瘤亞型，如結腸癌、胃癌等。胃癌組織通過miRNA 簇抑制細胞周期[10]。本研究以miRNA-9 為研究對象，研究焦點集中在預測靶基因和相關的miRNA。

miRNA-9 有3 種亞型，即miRNA-9-1、miRNA-9-2、miRNA-9-3；根據Gene Bank 可知它們都有CpG 島，其成熟體序列一樣，功能相似。在胃癌組織中發現其DNA 高度甲基化導致表達降低[11]。Tsai 等[12]研究表明，miRNA-9 是胃癌的抑癌基因，5-Aza-dC 去甲基化處理增加了miRNA-9 的表達，可抑制胃癌細胞增殖、遷移和浸潤。Wan 等[13]發現miRNA-9 在人胃腺癌組織中表達降低，miRNA-9過表達明顯抑制人胃癌細胞株和裸鼠腫瘤生長，miRNA-9 抑制核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）mRNA 和蛋白表達，提示其作為腫瘤抑癌基因發揮作用。

本研究發現，轉染miRNA-9 后，miRNA-9 對MKN-45 胃癌細胞的生物學行為有顯著影響。CCK-8 和Transwell 檢測顯示，過表達miRNA-9 可促進胃癌細胞的增殖和遷移能力，而下調miRNA-9則降低胃癌細胞的增殖和遷移能力，表明miRNA-9在MKN-45 細胞中起致癌基因的作用。miRNA-9表達在其他腫瘤中上調，表明其作用可能與致癌基因類似。在結腸癌細胞中，miRNA-9 抑制E-鈣黏蛋白表達，抑制miRNA-9 可恢復E-鈣黏蛋白活性；在E-鈣黏蛋白表達降低的結腸癌標本中，miRNA-9 表達顯著增加[14]。此外，miRNA-9 上調乳腺癌細胞中的E-鈣黏蛋白表達，增加細胞遷移和侵襲性。miRNA-9 介導的E-鈣黏蛋白下調導致血管內皮生長因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）表達上調和腫瘤血管生成。此外，在miRNA-9 過表達的乳腺癌小鼠模型中發現肺轉移，在高度惡性細胞中抑制miRNA-9 可以抑制轉移[15]。本研究結果與以上結論一致。Gao 等[16]認為miRNA-9 在胃癌組織和細胞系中的表達均低于癌旁組織和未分化胃上皮細胞，體內和體外實驗表明過表達miRNA-9 可抑制胃癌細胞和組織的增殖。目前發現很多未分化胃癌病例，存在胃上皮細胞內miRNA-9 基因突變，因此推測miRNA-9 起雙重作用，也許取決于目標靶基因及腫瘤類型。將來將建立動物模型，進一步研究miRNA-9 和靶基因的相關性。