胃癌患者術中腹腔沖洗液對脫落胃癌細胞增殖能力的影響△

雷璐敏，許欣琳

解放軍總醫院第四醫學中心手術室，北京1000480

國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）數據顯示，胃癌發病率居惡性腫瘤第5 位，病死率居第3 位。胃癌是中國常見的惡性腫瘤，其發病和死亡例數均約占全世界的50%[1-2]。隨著人口老齡化的加劇，預測中國胃癌的總發病例數還將逐年增加，疾病負擔呈上升趨勢[2]。手術是治療胃癌最直接、最有效的方法之一，然而，手術操作、用物使用等環節往往會提高腫瘤細胞醫源性播散的概率，而醫源性播散是腫瘤術后復發的一個重要原因[3-5]，術后復發給患者帶來巨大疾病創傷和負擔。因此，避免和減少手術中各環節造成的醫源性播散意義重大。臨床實踐中，在胃癌手術結束關閉腹腔前，采用腹腔沖洗液殺滅游離的胃癌細胞尤為重要，成為預防復發的最后一道防線。目前臨床對腹腔沖洗液滅瘤效果的研究多是通過顯微鏡觀察胃癌細胞形態學變化而間接判斷胃癌細胞是否具有種植、播散的能力。但是具有完整細胞形態的胃癌細胞是否一定具備種植、播散的能力值得進一步的探討研究。因此本研究通過精確的細胞噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測法探討不同腹腔沖洗液在不同溫度、不同作用時間點對胃癌細胞增殖活力的影響效果，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取胃癌細胞株MGC-803。試劑：蒸餾水、0.5%碘伏、特級胎牛血清、胰蛋白酶、苯酚紅、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline）、RPMI1640、MTT。儀器：倒置相差顯微鏡、正置熒光顯微鏡、CO2培養箱、酶標儀、離心機、氣浴恒溫箱、培養瓶、96 孔板、濾器。

1.2 MTT 檢測原理

哺乳動物活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將黃綠色的MTT 降解生成藍紫色的甲瓚結晶并沉積在細胞中，而死細胞無此功能[6]。二甲基亞礬（DMSO）可將細胞中的甲瓚溶解成紫色，用酶標儀在490 nm 波長處測定甲瓚的含量可定量測定細胞活力。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 實驗分為對照組、蒸餾水組和碘伏組，每組8 個孔。對照組給予RPMI1640 培養液，蒸餾水組給予蒸餾水，碘伏組給予0.5%碘伏。

1.3.2 細胞培養 細胞復蘇：取凍存管，放入37 ℃水浴中使凍存細胞融解。將融解的細胞懸液轉移到離心管中，加入新鮮的培養基離心兩次，最終移至細胞培養瓶中并加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養液，置于37 ℃的CO2培養箱中培養，次日換液，傳代1次后即可進行實驗。細胞傳代：用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養液培養細胞，培養條件為37 ℃、5%CO2，飽和濕度，每1～2 天換液1次。收集對數生長期細胞，調整細胞懸液濃度并鋪板，使待測細胞密度為1000/孔。37 ℃、5%CO2孵育12 h直至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）。

1.3.3 干預方法 分組加藥，觀察對照組、蒸餾水組、碘伏組在常溫（37 ℃）和高溫（43 ℃）下1、5、10、15、20、25、30 min 不同時間點細胞活力的變化。分組加藥后放置在恒溫箱中，確保每組在各個時間點溫度保持恒定狀態。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍攝記錄，隨后進行MTT 測定。

1.3.4 MTT 法測定細胞活力 每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續孵育4 h。孵育完畢后，終止培養，吸去孔內培養液。每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶標儀在490 nm 處測量各孔的光密度（optical density，OD）值。細胞活力=（加藥孔OD 值-加藥空白孔OD 值）/（對照孔OD 值-對照空白孔OD 值）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 常溫下各時間點對照組細胞活力的比較

常溫下各時間點對照組細胞OD 值比較，差異無統計學意義（P﹥0.05），均一性較好。（表1）

表1 常溫下各時間點對照組細胞的OD 值（±s）

表1 常溫下各時間點對照組細胞的OD 值（±s）

時間1 min 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min OD值100.00±8.92 100.00±4.81 100.00±4.08 100.00±35.02 100.00±5.67 100.00±12.15 30 min 100.00±18.65

2.2 不同溫度不同時間點各組細胞活力的比較

除37 ℃1 min 外，常溫和高溫各時間點蒸餾水組細胞OD 值均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）；常溫和高溫各時間點碘伏組細胞OD 值均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）；除37 ℃30 min 外，常溫和高溫各時間點碘伏組細胞OD 值均明顯低于蒸餾水組，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。43 ℃1 min 及25 min 時對照組細胞OD 值均明顯高于37 ℃，差異均有統計學意義（P﹤0.01）；蒸餾水組43 ℃1、5、10、20 min 時細胞OD 值均明顯低于37 ℃，15、25、30 min 時細胞OD 值均明顯高于37 ℃，差異均有統計學意義（P﹤0.01）；碘伏組43 ℃1、10、15、25 min 時細胞OD 值均明顯低于37 ℃，5、20、30 min 時細胞OD 值均明顯高于37 ℃，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表2）

3 討論

3.1 蒸餾水不同作用時間對胃癌細胞增殖活力的影響效果比較

研究報道，蒸餾水灌洗所形成的低滲作用可以使腫瘤細胞失去活性[7-8]。在本實驗中，蒸餾水對胃癌細胞增殖活力有明顯的抑制作用。在37 ℃作用下，隨時間的延長，胃癌細胞的生長趨勢明顯減弱，說明蒸餾水的低滲作用在較短的時間1 min 內就能達到破壞胃癌細胞形態的作用，但要達到100%細胞生長抑制的目標，還需要較長的作用時間。因此，蒸餾水對腫瘤細胞的生長抑制作用是有一定時效性的。在43 ℃作用下，各個時間點的細胞生長抑制率均優于常溫37 ℃，這與陳峻青等[9]的腹腔溫熱低滲液滅活腫瘤細胞的報道結果相同，即使浸泡時間延長到30 min，也不能達到100%腫瘤細胞滅活率。本實驗結果和Huguet 和Keeling[10]研究結果近似相近，其研究蒸餾水對結直腸癌手術過程中腹腔脫落腫瘤細胞的殺傷作用，發現蒸餾水作用于腫瘤細胞14 min 可以引起細胞裂解，30 min 才能達到完全滅活的效果。有研究者觀察不同作用時間蒸餾水對腫瘤細胞的滅活率，結果顯示15 s 時腫瘤細胞滅活率﹥10%，隨著時間的延長，腫瘤細胞滅活率逐漸升高，1 min 腫瘤滅活率﹥45%，5 min 腫瘤滅活率﹥95%，10 min 后腫瘤滅活率趨于穩定[11]。通過上述3 個類似研究不難發現不同學者認為溫熱蒸餾水確實對腫瘤細胞有殺傷效力，并且優于常溫蒸餾水，但達到100%腫瘤滅活率的浸泡時間從10 min 到30 min 不等，存在一定的爭議，分析原因可能與實驗樣本的選取有關，不同腫瘤細胞由于其生物特性的不同，對蒸餾水的反應時間不同，另外與實驗方法、觀察指標也有關系。本實驗發現43 ℃蒸餾水作用于胃癌細胞，確實能夠達到抑制胃癌細胞生長的目的，但抑制效果并沒有達到100%，但能夠發現蒸餾水滅活腫瘤細胞需要一定的時間，并且隨時間的延長胃癌細胞生長活力明顯降低。

表2 不同溫度不同時間各組細胞OD 值的比較（±s）

表2 不同溫度不同時間各組細胞OD 值的比較（±s）

注：a與同時間本組43 ℃比較，P<0.01；b與同時間同溫度對照組比較，P<0.01；c與同時間同溫度蒸餾水組比較，P<0.01

蒸餾水組37 ℃99.31±19.73a 71.64±10.01a b 54.41±5.99a b 50.75±15.94a b 62.71±9.68a b 22.30±4.29a b 4.67±1.04a b碘伏組37 ℃4.95±1.22a b c 2.52±0.22a b c 2.84±0.71a b c 5.49±0.86a b c 3.13±0.77a b c 4.23±0.85a b c 1.89±0.30a b對照組37 ℃100.00±8.92a 100.00±4.81 100.00±4.08 100.00±35.02 100.00±5.67 100.00±12.15a 100.00±18.65時間1 min 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 43 ℃17.32±3.13 48.75±9.05b 34.83±6.77b 68.34±15.94b 55.39±9.59b 47.79±11.40b 50.87±7.39b 43 ℃3.81±0.85b c 3.30±0.76b c 2.05±0.69b c 3.13±0.57b c 3.30±0.58b c 2.98±0.69b c 3.34±0.51b c 43 ℃161.55±16.58 91.07±17.93 86.67±9.26 112.73±10.25 91.27±6.77 120.62±19.25 111.46±8.10

3.2 碘伏不同作用時間對胃癌細胞增殖活力的影響效果比較

本研究結果表明37 ℃和43 ℃時碘伏對胃癌細胞增殖活力抑制作用均較明顯。隨著時間的延長，細胞活力降低，當作用時間達到10 min，胃癌細胞的增殖活力明顯降低。這與趙菊梅等[12]的實驗結果一致，碘伏在人體安全使用濃度范圍內對胃癌細胞有較明顯的抑制作用。但并不像Favoulet等[13]實驗中提到的能使腫瘤細胞全部死亡，分析原因為所選的腫瘤細胞種屬不同，碘伏的作用效果會有所差異。但是本研究中高溫碘伏組在作用時間超過10 min 后，細胞活力有所提高，分析其原因：一是碘伏主要是通過破壞細胞蛋白質產生不可逆的凝固作用達到殺滅胃癌細胞的目的，蛋白質凝固需要一定的時間，一旦完成蛋白質凝固作用，即使延長作用時間細胞活力變化不大；二是高溫可能對碘伏有一定的蒸發作用，隨著時間的延長，導致碘伏對胃癌細胞增殖活力抑制作用較前降低。

3.3 蒸餾水與碘伏對胃癌細胞活力的影響效果比較

在本研究中，兩種腹腔沖洗液對胃癌細胞生長均有不同程度的抑制作用，在實驗設計的7 個不同作用時間點，碘伏對胃癌細胞生長的抑制效果均遠遠高于蒸餾水，提示碘伏通過破壞胃癌細胞蛋白質，使其發生不可逆凝固所需時間遠遠短于蒸餾水低滲作用，說明碘伏的胃癌細胞生長抑制效果優于蒸餾水，能有效預防胃癌細胞的種植及播散。蒸餾水與碘伏都能達到抑制胃癌細胞生長的目的，但值得注意的是，本實驗結果顯示兩種腹腔沖洗液在30 min 的作用時間內都不能達到100%抑制細胞生長的目的。

術中腹腔沖洗是減少胃癌腹腔游離腫瘤細胞種植轉移的重要措施。因此，選擇科學的腹腔沖洗液至關重要[14]。綜上所述，蒸餾水和碘伏作為腹腔沖洗液可以抑制術中脫落的胃癌細胞的生長活力，減小其增殖的可能，從而避免胃癌細胞種植播散導致的術后腫瘤復發。蒸餾水抑制細胞生長所需時間較長不適用于臨床手術過程中術野沖洗，會帶來一系列的手術并發癥，如麻醉時間延長、切口暴露時間延長、患者手術不耐受等一系列問題。應用43 ℃、0.5%碘伏在10 min 的作用時間下，胃癌細胞生長活力控制在10%以下，雖沒有達到零生長，但較為理想。臨床應用時，應注意使用碘伏腹腔沖洗時的溫度、濃度和作用時間。本研究為科學選擇腹腔沖洗液，減少胃癌腹腔游離腫瘤細胞種植轉移提供了科學依據。