蘭科種子非共生萌發研究進展

齊凌雲，周芳美

（浙江中醫藥大學，浙江 杭 310000）

蘭科植物可以通過種子培養進行快速繁殖，雖然沒有功能胚乳，但是在自然條件下有適宜的共生菌參與可以進行萌發，可是萌發率低、數量少。原始環境的毀壞和人為過度采挖，加之種子本身的萌發條件十分苛刻，致使野生資源在原始生境的恢復異常艱難，造成野生蘭科植物極度瀕危。研究表明，種苗快繁是實現瀕危蘭科植物資源再生和合理開發利用的有效途徑，而種苗快繁技術的核心在于種子萌發[1]。目前大多采取人工接種共生真菌的方法來促使蘭花種子共生萌發；相比共生萌發，非共生萌發技術通過人為控制無菌環境，提供營養物質使許多蘭科植物的萌發和繁殖更加可靠，是研究蘭科植物生長發育的理想途徑。本文從蘭科種子的收集和預處理，對于其非共生萌發的處理和影響因素，以及使用非共生萌發的方法使其實現快速繁殖等方面的研究進行綜合概括。

1 蘭科植物與非共生萌發

關于蘭科種子的繁育方法，非共生萌發不需要真菌的參與，操作過程簡便，成本低，能在短期內獲得大量的幼小植株大大增加了蘭科植物規?；囵B的可行性，是有效、快速的繁育方法之一。目前對于蘭科種子非共生萌發體系的系統研究較少，而大多集中于利用不同種類的內生菌來促進蘭科種子的萌發，操作過程相對繁瑣，不利于實現蘭科植物的規?；敝?。目前研究表蘭科植物的種子儲存方便，且蒴果種子容易消毒，污染率低，采用非共生萌發優勢明顯。

1909年，Bernard以眉蘭屬的塊莖配制培養基，首次使卡德麗亞蘭與蕾麗亞蘭雜交種子成功萌發[2]。隨后，Arditt用非共生萌發法使不同類別的蘭花種子萌發，并成功培育出正常的種苗，其中有齒瓣蘭、石斛蘭、蝴蝶蘭、文心蘭、兜蘭等[3]。

蘭科種子實現非共生萌發的培養條件主要包括種子成熟度，溫度，光照，基本培養基的種類，植物激素（生長素類、細胞分裂素及其濃度配比），氮源，碳源（蔗糖、果糖、葡萄糖、海藻糖等），活性炭的添加，天然有機物提取物（土豆汁、香蕉汁、椰汁等）等[1]。通過控制這些影響因素可以調節蘭科種子的萌發，使得蘭科種子的活力更強、萌發速度更快、萌發率更高。

2 種子的收集和預處理

2.1 種子的收集和保存

蘭科植物蒴果內種胚的成熟度決定著蘭科植物的種子非共生萌發的萌發率，經查閱文獻發現種胚成長到20周時開始采集最好，這時種子含胚的概率最大，萌發率近乎100%，萌發所需時間為1周，且收集蒴果應在種子成熟但果莢尚未開裂前進行。一般收集和有效保藏種子的方法是在超凈工作臺上，先將蒴果浸入70～75%乙醇中消毒30s，后使用2.5%NaCLO溶液進行表面消毒15min，接著用無菌水沖洗數遍，隨后用無菌濾紙吸去殘留水分，最后使用無菌手術刀縱向切開蒴果，取出種子待用。乙醇、NaClO溶液濃度和消毒時間的確定可根據蒴果大小等因素酌情調整，運用的前后順序可視具體情況進行改變[1]。

成熟蘭科植物的種子在含水量大且貯藏溫度高的環境下，易發霉變質，失去生命力，貯藏時環境的溫度以及相對濕度越高，種子的退化速度就越快。在貯藏中，運用低溫技術具有顯著抑制種子中微生物生長的作用。微生物完成生命活動的最適溫度是在21～27℃之間，低溫可以延長種子的壽命，溫度降到0℃左右時，雖然仍有少量微生物能夠繼續發育，但其中大部分則是非常緩慢的。因而在貯藏種子時，應將其裝入密封的塑料袋，放置在0～5℃的冰箱里。研究表明在播種前將種子放置于低溫黑暗環境中，有助于破壞種子休眠，從而提高萌發率。此外，種子的含水量多少同貯藏過程中影響種子生存的其他因素之間的關系是非常重要的。為實現種子的長期儲藏需要排除各種有害因素，如種子含水量需小于9%，這樣可有效減緩種子的陳化過程。

2.2 種子的預處理

研究證實，種子經過恰當的預處理后可以有效提高種子的萌發率。這是由于有萌發抑制性物質（如木質素）存在于蘭科植物種子的種皮中，或是由于種皮自身妨礙了種子對氧氣及水分的吸收[1]。所以，為了促進蘭科種子的萌發，實現蘭科植物的快速繁殖，現使用較多的種子預處理方法主要分為物理、化學和生物三個方面。

物理上普遍采用磁性棒攪拌或超聲波法消除這種由種皮產生的抑制作用?；瘜W上則用KOH、NaOH、NaClO等溶液來破壞種皮并且達到消毒的效果。如劉思思等人發現用Ca（ClO）2劃破外種皮，之后在4～8℃下低溫層積8～12周可以提高陸生蘭種子的萌發率[1]；沈寶濤用NaOH溶液處理蘭科植物見血清種子推斷NaOH溶液的濃度及處理時間對種子萌發有極大的影響[4]。生物上可以用蝸牛酶等處理種子，沈寶濤對見血清種子的試驗表明適宜的蝸牛酶濃度在合適的處理時間下可明顯提高種子的萌發率，萌發率高于對照組，最高可達71.03%。除此之外，低溫層積也是常用的預處理方法之一。這些種子的預處理方式都可以不同程度的影響蘭科種子的萌發，對蘭科種子的非共生萌發以及快速繁殖的研究意義重大。

蘭科種子的胚發育不成熟，那么在萌發的過程中就無法提供充足的養分，致使種子萌發困難。在蘭科植物的無菌培養中對種子的合理處理可以大大提升種子的萌發速度和萌發率。采集和有效保存種子是實現蘭科植物種質資源可持續利用的前提，種子的預處理更是可以促進種子的快速萌發。找到有效的種子收集和預處理方式可以為珍貴藥用蘭科植物的快速繁殖帶來福音。

3 影響種子萌發的因素

蘭科種子非共生萌發的影響因素包括種子成熟度、溫度、光照、培養基種類和成分以及天然提取物等。

3.1 種子成熟度對種子萌發的影響

種子成熟度是影響種子萌發率的關鍵因素，在蘭科植物地生蘭中普遍存在未成熟種子的萌發率高于成熟種子的現象。Kaur S等人證明秀麗兜蘭未開裂之前的蒴果的種子較開裂后更易發芽[5]。其原因可能與不同時期種子種皮的機械阻力大小和透水透氣性、種胚發育程度、儲存的營養物質含量及可能存在的抑制物質等有關。

3.2 溫度對種子萌發的影響

蘭科植物種子的培養溫度普遍保持在20～30℃，大多數以25℃為宜。通常情況下，蘭科植物種子在這個溫度范圍內均能萌發，但不同種類的蘭科植物均有其最適的溫度區間，例如研究普遍認為鐵皮石斛生長的最適溫度為25℃左右。此外，在種子的預處理階段，研究表明將種子置于0～5℃或25℃的環境下保存一段時間，有助于打破種子休眠，提高萌發率且后者作用更顯著。華梅等人在對文山兜蘭種子非共生萌發的研究中發現種子在播種前經過低溫處理73d后，文山兜蘭種子萌發時間可提前13d，萌發率達到59.33%[6]。

3.3 光照對種子萌發的影響

有資料顯示，蘭科植物種子的感光不是必需的而是光促進類型。蘭科植物種子所需的光照周期因種而異，不同種類的種子有些需要全暗培養而有些則需要光暗交替培養，李雨晴的試驗證明白及種子無菌萌發初期給予光照可提高萌發率，暗培養的白及種子萌發率顯著低于光照培養[7]。Philip等的試驗證明黑暗條件可以促進Calopogon tuberosus的種子萌發[8]。二者的研究同時表明當種子發育到原球莖階段需給予適當光照對幼苗的生長和發育有益處。

3.4 培養基的種類、組分及培養方式對種子萌發的影響

3.4.1 基本培養基的種類對種子萌發的影響

通過查閱文獻整理出幾種不同類別蘭花的非共生萌發培養基配方，如表1所示。通常使用的培養基有MS、1/2MS、RE、KC（Kundson C）、花寶 （Hyponex）等，不同蘭花種子在不同培養基上萌發率存在著一定差異。據研究表明，MS或者1/2MS培養基具有無機鹽和離子濃度較高、溶液離子平衡相對穩定、養分含量及比例適宜等特點，能夠迎合蘭科植物的營養以及生理需求，故其應用較其他基礎培養基更多。

表1 幾種蘭花非共生萌發的培養基配方

3.4.2 培養方式

蘭科植物非共生萌發利用的培養基是由人工配制的，促進和保障植物組織生長的養料。按照培養基的物理狀態可將其分為固體和液體兩種類型。固體培養的轉接次數少，節約勞力和設備投入。然而有研究表明，液體懸浮培養通過與蘭科種子充分接觸更有助于種子萌發，表現在種子萌發提前，原球莖顏色翠綠且形態飽滿，生長速度快，同時在液體培養基上繼續培養不易分化。華梅等人在對文山兜蘭種子非共生萌發的研究中發現文山兜蘭種子在液體懸浮培養基中無論萌發時間還是萌發率上都明顯優于固體培養基，并且以花寶1號作為培養基能明顯提高萌發率[6]。Thompson等開創性地采用雙相培養基，以增進南非Disa屬的蘭花不成熟種子萌發，培養基由富含活性炭的固態培養基和覆蓋在其上的降低強度的相同類型的液體培養基構成。前者用來消彌過濾后的苯酚的影響而且使得原球莖形成極性，并且后者能有效增強水的利用。相比舊的培養方法，種子萌發的速度更快，而且許多種類的種子萌發率接近于它們的估計萌發潛力[13]。

3.5 天然提取物與活性炭對種子萌發影響

天然提取物如香蕉勻漿、椰子汁等含有氨基酸、激素和酶等的有機物，是成分相對復雜的天然復合物，添加適宜種類和濃度的天然提取物對種子的萌發有顯著的促進作用，這一結論已有諸多論證。然而，如果培養基中添加了不適宜的天然提取物，不但不會促進萌發，甚至會帶來不利影響，如唐麗等人對鐵皮石斛的研究中發現適量馬鈴薯可以促進種子萌發而添加椰乳則對其有不利影響[14]。

活性炭能吸附分泌到培養基中的抑制性的和有害的物質，對抑制褐變有顯著作用，這樣可以大大減少已萌發種子的死亡率，但由于活性炭也有副作用，即活性炭的加入常使培養基的成分變得復雜，因此在培養時需根據物種選擇是否添加。

綜合上述影響因素，通過對種子進行預處理，合理控制溫度和光照等因素，選擇合適的培養基和培養方式，優化改良培養基配方能夠有效促進種子萌發。

4 問題與展望

非共生萌發是植物快速繁殖的一種方式，相比于自然環境下生長的植物，它能夠避免人為和自然的災害，保持穩定的生長，進而讓珍稀植物保持一定的數量，被人們所利用，但是目前的技術還不能夠廣泛應用，仍存在以下問題：第一，實驗對環境要求嚴苛，過程中需要保證無菌環境。第二，在有效保存種子的問題上，需要嚴格控制好試劑用量以及貯存條件。第三，蘭科種子的胚發育不完全，在萌發過程中要提供足夠的養分以及合適的處理。

珍稀蘭科植物具有很高的藥用價值，隨著對蘭科植物的需求不斷增加，其數量因自然與人為因素的制約逐漸無法滿足需求，人們也很少在珍稀蘭科植物的快速繁殖上開展大量工作。今后，人們對于藥材的培養與保護會更加重視，更多的創新技術會在這個領域應用和體現。讓蘭科植物實現快速繁殖，提高藥材的數量和品質，能夠在資源保存和獲取方面取得重大突破，展現出無可比擬的優勢與前景，開拓了廣闊的市場。因為蘭科植物在自然環境下的生長遭到阻礙，所以需要依靠非共生萌發技術，幫助其發育成長，這將會對醫藥學事業做出巨大貢獻。