豬肺炎支原體中空纖維膜濃縮純化工藝研究

車巧林 董彥鵬 耿曉眉 郁偉軍 徐 鳳

（江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司，江蘇江陰 214400）

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhyo）是引起豬支原體肺炎的主要病原。豬支原體肺炎除引起豬的生長受阻和飼料轉(zhuǎn)化率降低外，重要的是它能破壞豬呼吸道黏膜纖毛屏障，從而引起多種病原的繼發(fā)感染和混合感染，引起豬呼吸道疾病綜合征，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。

疫苗在疾病預(yù)防中的地位日益重要，因此對疫苗質(zhì)量的要求也日益提高。在傳統(tǒng)和新型疫苗的制備中，應(yīng)用先進的分離純化技術(shù)是提高疫苗效力、降低副反應(yīng)的有效手段。疫苗純化過程中常使用的方法有連續(xù)離心、沉淀、過濾、萃取、超速離心、微濾、超濾、層析等。傳統(tǒng)的離心、過濾、萃取和沉淀技術(shù)目前更多的是作為整個疫苗分離純化工藝的起始步驟，用于初步提純；而后期的超速離心、微濾、超濾、層析技術(shù)等方法則進一步提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，使其達到疫苗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

中空纖維超濾是超濾技術(shù)中最為成熟與先進的一種技術(shù)，它采用切向流過濾，即液體流動方向與過濾方向垂直。與傳統(tǒng)的液體死端過濾相比，切向流過濾具有濾速快、效率高、不易堵塞的優(yōu)點，而且可根據(jù)需要控制濃縮和洗濾倍數(shù)，因此，在生物制品的生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。豬肺炎支原體大小200 nm左右，不適合采用超速離心和層析技術(shù)分離，因此選擇超濾技術(shù)對其進行濃縮純化。本研究初步建立了豬肺炎支原體中空纖維濃縮純化工藝，并對豬肺炎支原體滅活菌液進行濃縮純化，獲得了較好的效果。

1 材料

1.1 菌株

豬肺炎支原體HN0613株（代次F6），由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司鑒定并保存。

1.2 主要試劑及儀器

Friis基礎(chǔ)液及Friis培養(yǎng)基由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司自制；2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA）購自 Sigma Aldrich 公司；無水硫代硫酸鈉購自Alfa Aesar公司。

300 kD、500 kD、750 kD中空纖維超濾柱、0.1 μm中空纖維微濾柱購自GE公司。豬肺炎支原體微量間接血凝（IHA）檢測試劑盒由江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司自制；50 L發(fā)酵罐購自上海百侖生物科技有限公司，超濾系統(tǒng)購自利穗科技有限公司。

1.3 試驗動物

1～1.5kg日本大耳白兔，豬肺炎支原體IHA抗體陰性（效價＜1：5），購自蘇州湖橋生物科技有限公司。

2 方法

2.1 豬肺炎支原體菌液的制備

豬肺炎支原體HN0613株凍干菌種用Friis培養(yǎng)基溶解，以10%比例接種于Friis培養(yǎng)基，37 ℃ 靜置培養(yǎng)，pH 6.7～6.8時收獲。收獲菌液以5%比例傳代兩次后再以4～5%的比例接種發(fā)酵罐，通氣量設(shè)置為0.8 Nm3/h，罐壓維持0.06 MPa，37℃培養(yǎng)2～4d，待pH下降至6.7～6.8時收獲，收獲菌液進行無菌檢驗及CCU測定。

2.2 中空纖維膜孔徑大小的選擇

使用300 kD、500 kD、750 kD和0.1 μm的中空纖維膜分別對豬肺炎支原體活菌液進行濃縮純化，剪切速率控制在3 000 s-1，跨膜壓TMP控制在0～10 psi，將抗原濃縮5倍后用無菌PBS進行動態(tài)平衡洗濾。每次洗濾液取1mL用于總蛋白含量測定。

2.3 純化過程中洗濾液的選擇

使用750 kD的中空纖維膜對豬肺炎支原體活菌液進行濃縮純化，剪切速率控制在3 000s-1，跨膜壓TMP控制在0～10 psi。第一次純化，抗原濃縮5倍后用無菌PBS動態(tài)洗濾5次；第二次純化，抗原濃縮5倍后用無菌不含豬血清的Friis基礎(chǔ)液（以下簡稱Friis基礎(chǔ)液）動態(tài)洗濾5次。濃縮、純化過程中的透過液和洗濾液均取1 mL用于CCU測定。

2.4 純化過程中剪切速率的選擇

使用750 kD中空纖維膜對豬肺炎支原體活菌液進行濃縮純化，剪切速率分別控制在1000 s-1、2 000 s-1、4 000 s-1、6 000 s-1和8 000 s-1，跨膜壓TMP控制在0～10 psi，抗原濃縮5倍后用Friis基礎(chǔ)液動態(tài)洗濾5次，收集過程中計算通量，并對最后收獲的截留液進行CCU測定。

2.5 豬肺炎支原體滅活菌液的濃縮純化

豬肺炎支原體活菌液經(jīng)終濃度0.4 mM BEI滅活，10 mmol/L硫代硫酸鈉終止后，取少量進行滅活檢驗，檢驗合格后用于純化。

使用0.1μm中空纖維膜對豬肺炎支原體滅活菌液進行濃縮純化，剪切速率控制在4 000 s-1，跨膜壓TMP控制在0～10 psi，將抗原濃縮5倍后用Friis基礎(chǔ)液洗濾7次，每次洗濾取30ml洗濾液。通過SDS-PAGE分析豬肺炎支原體滅活抗原純化前及濃縮純化過程洗濾液蛋白圖譜，BCA法測定純化前及濃縮純化過程中總蛋白含量。

2.6 豬肺炎支原體滅活菌液純化前后免疫原性測定

豬肺炎支原體純化洗濾3次、5次和7次的收集液先分別稀釋5倍恢復(fù)至原液，然后連同豬肺炎支原體純化前滅活菌液與Gel佐劑分別乳化配苗，免疫1～1.5kg豬肺炎支原體IHA抗體陰性的健康日本大耳白兔，每組免疫5只，每只后腿肌肉注射疫苗0.5 ml。免疫后14d，以相同劑量和途徑進行二免，剩余5只不免疫作為陰性對照。二免后28d，所有兔子采血、分離血清，IHA檢測兔血清中豬肺炎支原體抗體效價，評判純化過程中經(jīng)不同次數(shù)洗濾豬肺炎支原體免疫原性是否受到影響。

3 結(jié)果

3.1 豬肺炎支原體菌液的制備

50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的豬肺炎支原體菌液無菌檢驗合格，CCU測定結(jié)果為109CCU/ml。

3.2 中空纖維膜孔徑大小的選擇

通過BCA法測定純化前及各個孔徑中空纖維膜濃縮純化過程中收集液的總蛋白含量，以此計算雜蛋白去除率，結(jié)果見表1。豬肺炎支原體活菌液經(jīng)300 kD、500 kD、750 kD和0.1μm中空纖維膜濃縮5倍、洗濾5次后雜蛋白去除率分別為63.57%、70.79%、81.27%和86.10%，由此看出750 kD和0.1 μm中空纖維膜純化效果較好，蛋白去除率達80%以上。

3.3 純化過程中洗濾液的選擇

通過對比無菌PBS和Friis基礎(chǔ)液兩種洗濾液濃縮、純化過程中透過液、收集液的CCU，評判濃縮純化過程中豬肺炎支原體的回收率，結(jié)果見表2。從表中可以看出豬肺炎支原體活菌液經(jīng)750 kD中空纖維膜濃縮5倍后CCU是濃縮前的5倍，且濃縮及純化過程中透過端沒有檢測到CCU，但是用PBS洗濾時隨著洗濾次數(shù)的增加豬肺炎支原體的CCU在降低，洗濾5次后CCU僅為105，而用Friis基礎(chǔ)液洗濾5次豬肺炎支原體CCU仍為濃縮前的5倍，5×109，這說明純化時用Friis基礎(chǔ)液洗濾，活菌液回收率遠遠高于PBS洗濾時的活菌液回收率。

表1 Mhyo菌液經(jīng)不同孔徑中空纖維膜濃縮純化過程中總蛋白含量及雜蛋白去除率

表2 純化過程中不同洗濾液洗濾對Mhyo活菌液CCU和抗原回收率的影響

3.4 純化過程中剪切速率的選擇

使用750 kD的中空纖維膜對豬肺炎支原體活菌液進行濃縮純化，不同剪切速率下的通量及截留液豬肺炎支原體CCU見表3，從中可以看出剪切速率在2 000 s-1以上時，通量可以達到20 L/h以上，適合生產(chǎn)中抗原的大量處理，但是當(dāng)剪切速率達到8 000 s-1時，豬肺炎支原體活菌液CCU降到108，因此豬肺炎支原體純化過程中剪切速率應(yīng)控制在2 000～6 000s-1。

表3 不同剪切速率下的通量及Mhyo活菌液CCU

3.5 豬肺炎支原體滅活菌液的濃縮純化

使用 0.1 μm中空纖維膜對豬肺炎支原體滅活菌液進行5倍濃縮，并用Friis基礎(chǔ)液洗濾7次，收集濃縮液及洗濾液，通過SDS-PAGE分析豬肺炎支原體滅活菌液純化前及濃縮純化過程中蛋白圖譜，BCA法測定純化前及濃縮純化過程中總蛋白含量，以此判斷和計算雜蛋白去除率，結(jié)果見圖1和表4。從圖1可以看出洗濾4次后雜蛋白明顯減少，從表4可以看出豬肺炎支原體滅活菌液經(jīng)0.1 μm中空纖維膜濃縮5倍、洗濾7次后雜蛋白去除率可以達到94.66%。

圖1 Mhyo滅活菌液純化前及純化過程中洗濾液SDS-PAGE；

表4 Mhyo滅活菌液濃縮純化（0.1 μm）過程中總蛋白含量及雜蛋白去除率（BCA法）

3.6 豬肺炎支原體滅活菌液純化前后免疫原性測定

豬肺炎支原體純化洗濾3次、5次和7次的收集液，豬肺炎支原體純化前滅活菌液與Gel佐劑分別乳化配苗，免疫1～1.5 kg豬肺炎支原體IHA抗體陰性的健康日本大耳白兔，二免后28天采血分離的兔血清用IHA測定豬肺炎支原體抗體效價，結(jié)果見表5，從表中可以看出，豬肺炎支原體滅活菌液濃縮5倍洗濾7次，豬肺炎支原體平均效價與濃縮前相比沒有明顯差異，說明豬肺炎支原體經(jīng)0.1 μm的中空纖維膜濃縮純化仍能保持良好的免疫原性。

表5 Mhyo滅活菌液純化前及純化過程中免疫原性（抗體效價）變化

4 討論

隨著社會科技的日新月異，膜在生活科技領(lǐng)域的應(yīng)用不斷擴大并發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在膜分離領(lǐng)域中，超濾、微濾是兩種應(yīng)用最為廣泛的膜過程，主要用于化工分離與精制、廢水處理、膜生物反應(yīng)器等。中空纖維膜具有比表面積大、產(chǎn)量高、便于加工制作、造價低、易于維護管理等優(yōu)點，因此得到了廣泛的應(yīng)用和研究?，F(xiàn)階段，中空纖維超濾膜廣泛應(yīng)用于酶提純與分級、中藥制劑的制備、抗生素的濃縮與精制、疫苗的濃縮與純化、菌體的去除，地表水、飲用水、廢水處理等分離過程。

超濾技術(shù)在疫苗純化領(lǐng)域首先應(yīng)用在重組乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg上，早在1989年，Youn和Samanta用超濾膜對HBsAg哺乳動物細胞培養(yǎng)液進行10倍濃縮，隨后通過聚乙二醇沉淀、凝膠過濾柱層析、KBr密度超離心和蔗糖密度梯度超離心獲得純度大于98%的HBsAg。1992年，Chai等應(yīng)用截流量100kD的中空纖維超濾膜對含有HBsAg的酶解液進行了濃縮純化，回收率高達97.7%，用該方法獲得的抗原制備的B型乙肝疫苗用于兒童疫苗接種，抗體陽性轉(zhuǎn)化率為100%，且重組疫苗質(zhì)量高于從乙肝病毒攜帶者血液中提取乙肝表面抗原制成的疫苗。2012年，胡業(yè)勤等采用中空纖維超濾法純化脫毒后的無細胞百日咳抗原，并與透析法進行了對比，結(jié)果顯示超濾法去除無細胞百日咳抗原溶液中脫毒劑和色素的效率更高，3 h內(nèi)即可完成，且所得原液的回收率為92.1%，接近透析法的回收率，原液效價為11.166 IU/ml，高于透析法獲得的原液效價9.211 IU/ ml。本研究對豬肺炎支原體菌液進行了中空纖維超濾膜濃縮純化工藝摸索，確定了超濾膜孔徑大小、洗濾液及剪切速率，并對滅活菌液進行濃縮純化，測定了雜蛋白去除率，以及濃縮前后豬肺炎支原體免疫原性的變化，結(jié)果表明應(yīng)用中空纖維膜對豬肺炎支原體進行濃縮純化可以獲得滿意的效果，考慮到大規(guī)模生產(chǎn)中抗原處理量大，建議疫苗生產(chǎn)中使用0.1 μm微濾膜。