PRRSV 不同毒株RT-PCR 檢測方法的建立與應用

饒云萍 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道疾病為特征的傳染病[1]。1987 年美國首次報道該病，隨后歐洲和亞洲等地區(qū)陸續(xù)報道[2]。 1995 年我國首次有關于PRRS 的描述，1996 年郭寶清等分離確定了引起該疫病流行的病原-PRRSV（CH-1a 株），隨后世界各地呈大面積流行， 給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。 根據(jù)該病在我國的流行特點和臨床表現(xiàn)，可分為3 個流行趨勢。 1995-2004 年以經(jīng)典PRRS 為主，主要表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸道癥狀，代表毒株分別為CH-1a 株、BJ-4 株[4]；2005-2014 年以高致病性PRRS 為主，主要表現(xiàn)為高熱、高發(fā)病率和高病死率，代表毒株分別為JXA1 株、HuN4 株和TJM 株[5]；2015-2019 年多種毒株并存，NADC30-like 毒株普遍流行，其基因組核苷酸同源性低，重組頻繁，母豬以流產(chǎn)為主，各階段豬只以呼吸道癥狀為主[6]。PRRS臨床變化呈多樣性， 給該病的臨床診斷帶來很大困難。 目前運用RT-PCR 技術和基因測序等分子生物學技術，是鑒別PRRSV 分離株最為有效的手段。

根據(jù)經(jīng)典PRRSV、 高致病性PRRSV （HPPRRSV） 及NADC30-like 株Nsp2 基因上存在不同數(shù)量核苷酸的缺失， 在缺失區(qū)域兩端的保守區(qū)設計通用引物 （見圖1）， 建立了一種快速準確靈敏的RT-PCR 檢測方法[7]。該方法不僅可以有效節(jié)約時間和成本，還為PRRS 的早期診斷、流行病學調查及免疫防控提供科學依據(jù)。

圖1 引物設計原理模式

1 材料與方法

1.1 病毒株 豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 （CH-1R株）、NADC-30like 株質粒、豬瘟病毒（HCV）、豬圓環(huán)病毒（PCV-2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）及豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）均由兆豐華生物科技（福州）有限公司提供，高致病性疫苗株購自廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司。

1.2 主要試劑 RNA viral kit 購自Omega 公司；AMV 反轉錄酶、Random primer、DL2000 DNA marker 和dNTPs(2.5 mmol/L)均購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR Master Mix(2×)購自天根生化科技有限公司。

1.3 Nsp2 基因引物設計與合成 參照GenBank 中登錄的 PRRSV、HP -PRRSV 及 NADC30 -like PRRSV Nsp2 基因序列， 通過Primer Premier 5.0 和Oligo 7.0 軟件在其保守區(qū)設計引物。Nsp2 基因引物序列為，F(xiàn)：5'-TTTGATTGGRATGTTGTGCT-3'；R：5'-TGAGTAYTTTGGGCGTGTGAT-3'。 擴增的目的片段大小分別為1 000 bp、900 bp 和700 bp。 引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA 的提取和cDNA 的合成 使用RNA viral kit 試劑盒提取總RNA， 具體操作按說明書進行。 利用AMV 反轉錄酶將RNA 反轉錄成cDNA，具體操作參照說明書進行，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PRRSV Nsp2 基因擴增與測序 以提取的樣品cDNA 為模板， 用所設計的引物進行PCR 擴增，反應體系(50 μL)：2×PCR Master Mix 25 μL、上下游引物(20 μmol/mL)各2.5 μL、cDNA 2 μL，補充去離子水至終體積為50 μL。 PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，55.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 反應結束后，加樣品3 μL 用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。 對有目的條帶的擴增產(chǎn)物送上海生物工程技術有限公司進行序列測定。

1.6 引物特異性試驗 分別以圓環(huán)病毒、偽狂犬病病毒的DNA 和豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒的cDNA 為模板進行PCR 擴增，用以驗證引物的特異性。

1.7 臨床應用 用建立的RT-PCR 方法對臨床樣品進行檢測，并設立陰性對照。

2 結果與分析

2.1 PRRSV 不同毒株的PCR 擴增 通過RTPCR 方法對經(jīng)典PRRSV 疫苗株擴增出一條大小為1 000 bp 的目的片段，高致病性PRRSV 疫苗株擴增出一條大小為900 bp 的目的片段，對NADC30-like株擴增出一條大小為700 bp 的目的片段，與預期目的片段一致且差異明顯（見圖2）。 將目的條帶進行純化、克隆、測序，經(jīng)Blast 比對分析，與GenBank 中的PRRSV Nsp2 序列相似度高達99%以上。

圖2 RT-PCR 擴增結果

2.2 特異性試驗 對經(jīng)典PRRSV 疫苗株、 高致病性PRRSV 疫苗株、NADC30-like 株、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒進行RNA 提取與cDNA 合成， 對圓環(huán)病毒和偽狂犬病病毒進行DNA 提取， 以上述cDNA 和DNA 按照上述的PCR反應體系和條件進行擴增。 瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3，設計的引物僅可從PRRSV 不同毒株中擴增出相應目的條帶，其它均無特異性擴增條帶，提示該方法具有良好的特異性。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳結果

2.3 臨床應用 用建立的RT-PCR 檢測方法對58 份疑似PRRSV 感染豬的肺臟、 脾臟和淋巴結等進行總RNA 提取， 并對其反轉錄成cDNA 進行擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示34 份為陽性（陽性率58.62%）。 其中經(jīng)典PRRSV 3 份（占8.82%），HP-PRRSV14 份 （占41.18%），NADC30-like 檢出5 份 （占14.71%）， 經(jīng)典PRRSV 與HPPRRSV 共 感 染3 份，NADC30-like 與HP-PRRSV共感染9 份，多毒株共感染計12 份（占35.29%），提示HP-PRRSV 仍占主導，但多毒株共感染成為流行趨勢。HP-PRRSV 還可以細分為JXA1 株、TJM 株和HuN4 等，所以，總體數(shù)量大于其他類別的毒株。

3 結 論

目前PRRSV 的鑒定方法主要包括血清學試驗和分子生物學試驗。血清學試驗如免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附、中和反應、免疫組化等主要用于抗體檢測，通常不能區(qū)分抗體是來自經(jīng)典毒株、 高致病性毒株還是NADC30-like 毒株的感染。 分子生物學試驗包括常規(guī)PCR、原位雜交、環(huán)介導等溫擴增技術、熒光定量PCR 等， 該類方法靈敏度高、 特異性強、耗時短。目前分子生物學技術發(fā)展迅速，Spear A 等[8]針對PRRSV Nsp9 序列建立同時可以檢測出2 種PRRSV 的實時熒光定量PCR 檢測方法。 張杰等[9]根據(jù)PRRSV ORF7 基因序列設計引物，建立了檢測該病毒的SYBRGreen I 染料熒光定量PCR 方法。項明源等[10]根據(jù)NADC30-like 毒株Nsp2 基因保守序列設計特異性引物， 建立了PRRSV NADC30-Like 毒株熒光定量PCR 檢測方法。

上述檢測方法均具有靈敏度高、準確、快捷的特點，但熒光定量PCR 最大的不足就是設備和試劑昂貴， 且目前研究的方法只能針對某一類PRRSV，不能一次有效地區(qū)分多種毒株。 近年來，NADC30-like成普遍流行毒株， 通過對比發(fā)現(xiàn)其基因組與PRRSV、HP-PRRSV 差異很大，這對于PRRS 的診斷檢測帶來新的挑戰(zhàn)。 而本研究是基于經(jīng)典PRRSV、HP-PRRSV 及NADC30-like PRRSV 的Nsp2 基 因上存在不同數(shù)量核苷酸的缺失，通過RT-PCR 技術對PRRS 病毒分離株進行鑒別，該方法操作簡單、成本低廉、 用時少， 可以快速檢測并鑒別出不同的PRRSV 毒株，為PRRS 流行病學調查及免疫防控提供科學依據(jù)。 利用該方法對圓環(huán)病毒、 偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒等豬源性病毒進行檢測，結果均為陰性，說明該方法具有良好的特異性。

臨床檢測結果發(fā)現(xiàn)， 大部分患豬存在多種PRRSV 毒株感染的情況， 共感染呈廣泛流行性，且NADC30-like 有增多的趨勢。 這與國內大部分地區(qū)的研究一致，如王艷午等[11]于2016-2017 年在廣東地區(qū)分離的PRRSV 以高致病性毒株為主， 并且開始出現(xiàn)NADC30-like 毒株，呈現(xiàn)多毒株共感染。 林志鋒等[12]從福建某豬場采集9 份疑似感染PRRSV的豬病料進行病毒分離及分離毒株ORF5、ORF7 基因擴增， 結果顯示2 株為PRRSV 與HP-PRRSV 的重組毒株，5 株屬于NADC30-like PRRSV。

目前由于非洲豬瘟疫情的影響， 養(yǎng)豬業(yè)各類疫苗（包括PRRS 疫苗）的使用大幅減少，隨著國家大力支持復養(yǎng)，生豬數(shù)量可能快速增加，PRRS 也許將出現(xiàn)又一輪的流行， 養(yǎng)殖場應根據(jù)監(jiān)測數(shù)據(jù)及臨床使用效果給予合理的免疫接種。 由病毒學基礎理論可知，PRRS 疫苗對新病毒也會有交叉免疫保護作用。 因此，我國養(yǎng)豬場做好PRRS 疫苗免疫，并加強環(huán)境和生物安全管理，不僅可及早控制和清除病毒，也為病毒的重組減少了機會。