T2 毒素單克隆抗體及試劑盒的制備

方勤美 劉建龍 陳永聰 柯 翎 鄭在予 陳秀霞 龔 暉

（福建省農業科學院生物技術研究所 福州 350003）

T2 毒素屬于A 型單端孢霉烯族化合物，主要由三線鐮刀、枝孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、梨孢鐮刀菌和硫色鐮刀菌等真菌代謝產生[1]。 食物和飼料中經常檢測真菌毒素，其中T2 毒素最強，是蛋白質合成的強抑制劑[2]。 研究證明[3]，T2 毒素可在體內產生更強的毒素物質，目前沒有有效的治療手段，對人類食物、動物飼料及健康具有潛在危害，唯有預防監測是唯一有效管控途徑。 所以，建立一套靈敏、快捷的檢測方法已成為近年來的研究熱點。

目前，已有氣相色譜法[4]、氣相色譜串聯質譜法[5]、高效液相色譜法[6]和液相色譜串聯質譜法[7]等用于T2 毒素檢測， 但這些方法需具備相關儀器和專業人員，檢測成本昂貴，建立一套更簡便實用的方法尤為重要。本試驗制備單克隆抗體，并建立酶聯免疫吸附試驗方法， 為食品和動物飼料中檢測T2 奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 T2 毒素免疫原為本室合成并保存。6～8 周齡BALB/c 小鼠購自北京，羊抗鼠的IgG、牛血清白蛋白(BSA)、96 孔板條、PBS 緩沖液購自SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫與細胞融合 按經典程序免疫BALB/c小鼠。選出1 號小鼠進行細胞融合試驗后，45%細胞培養孔中長出雜交瘤細胞株， 用間接非競爭性ELISA 篩選，并用間接競爭法確證，從中選擇出一株效價高又能被T2 毒素強抑制的雜交瘤細胞，經3 次克隆化后，克隆陽性率達100%，將其凍存于液氮罐中。

1.2.2 T2-OVA 板孔的制備 將T2-OVA 用CBS緩沖液稀釋至0.06 ug/mL，充分混勻后，在96 孔板的每孔中加入50 uL，37 ℃溫育2 h， 用PBST 洗板4 次，每次間隔3 min；拍干后加滿封閉液，4 ℃封閉過夜，洗板；晾干后將板條密封置于冰箱保存，備用。

1.2.3 抗體效價測定 采用間接ELISA 測定小鼠的血清效價。 取經包被好的T2-OVA 板孔，每孔中加入50 uL 無菌PBS，然后自第一排依次加入50 uL小鼠血清，倍比稀釋至倒數第2 排，最后1 排為空白對照，37 ℃孵育20 min， 用洗液洗板3 次； 每孔加50 uL 羊抗鼠酶標二抗，37 ℃孵育20 min，用洗液洗板5 次；每孔加50 uL 顯色液，室溫振蕩反應10 min；每孔加入50 uL 終止液，用酶標儀讀取OD450值。

1.2.4 抗體對T2 毒素半數抑制濃度（IC50） 的測定采用間接競爭ELISA 鑒定單克隆抗體對T2 毒素半數抑制濃度（IC50）。 具體操作如下：加不同濃度的T2毒素標準品溶液50 uL 作為抑制劑；加T2 毒素單克隆抗體50 uL， 反應20 min， 用洗液洗板3 次；每孔加50 uL 羊抗鼠酶標二抗，37 ℃孵育20 min，用洗液洗板5 次；每孔加50 uL 顯色液，室溫振蕩反應10 min； 每孔加入50 uL 終止液， 用酶標儀讀取OD450值。1.2.5 T2 毒素檢測試劑盒的制備 試劑盒方法采用競爭法測抗原， 板孔底部包被羊抗鼠的IgG （二抗），利用T2 毒素的單克隆抗體既可以與底部包被二抗結合又可與自身抗原（T2 毒素）結合的特點，將其固定在板孔底部的同時， 使標準品或待測物與酶標抗原與其競爭結合。洗去游離的物質后，固相上的酶量與標準品或待測物為一定的比例關系， 加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與酶量呈正相關， 與標準品或待測物的量呈負相關，故可根據顏色的深淺進行定性或定量分析。

2 結果與討論

制備的腹水效價為1:1.024×106，純化后的抗體效價為1:5.76×105。 抗體活性保持良好。

2.1 單克隆抗體效價測定 結果判定標準：待測孔OD450值/空白孔OD450值≥2.1，判定該抗體效價為1:5.76×105。 表1 結果顯示，抗體效價達到1:36 000。

2.2 篩選合適的單克隆抗體 計算出抑制率B/B0的值（B0為不加T2 毒素標準品時的吸光值，B 為加不同質量濃度T2 毒素標準品的吸光值），以B/B0的結果為縱坐標，以T2 毒素質量濃度（ng/mL）的對數值為橫坐標， 繪制T2 毒素對小鼠多抗血清的抑制曲線，根據繪制的標準曲線推導出回歸方程，計算出小鼠多抗血清對T2 毒素的半數抑制濃度(IC50)為2.0 ng/mL，見圖1、表2-表3。

圖1 T2 毒素半數抑制濃度（IC50）測定抑制曲線

經綜合分析， 選擇酶標抗原稀釋12 000 倍、抗體稀釋2 000 倍的組合為宜。

2.3 抗體對T2 毒素半數抑制濃度（IC50）的測定 從表4 結果可知， 抗體對T2 毒素半數抑制濃度（IC50）為8.96 ng/mL。

表1 抗體效價測定

表2 小鼠多抗血清對T2 毒素半數抑制濃度(IC50)的測定

表3 單克隆抗體與酶標記物配比測定

表4 抗體對T2 毒素半數抑制濃度（IC50）的測定

2.4 用試劑盒進行測試 從表5 結果可知，該試劑盒的靈敏度和回歸率效果都很好， 試劑盒可用于大量樣本的測評。

表5 試劑盒測評