三角梅炭疽病病原分離與鑒定研究報(bào)告

張勝男

摘? ?要：為明確三角梅炭疽病的具體致病菌，采用形態(tài)學(xué)鑒定法對(duì)三角梅感病組織部位進(jìn)行切片和組織分離，以離體葉片接種法驗(yàn)證病原菌的致病性。通過(guò)切片法對(duì)病原菌分生孢子器及分生孢子形態(tài)進(jìn)行鑒定;通過(guò)組織分離法對(duì)致病菌的菌落形態(tài)及分生孢子等生長(zhǎng)形態(tài)進(jìn)行觀察鑒定，確定了該致病菌為炭疽菌屬膠孢炭疽菌，從而為有效防控該病害提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：三角梅;炭疽病;膠孢炭疽菌;分離;鑒定

文章編號(hào)： 1005-2690（2020）16-0010-02? ? ? ?中圖分類號(hào)： S435.675? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

三角梅是紫茉莉科葉子花屬木質(zhì)藤本狀灌木，原產(chǎn)于南美洲巴西。苞片有紅、黃、紫、白等多種顏色，其五彩繽紛的表現(xiàn)特征契合我國(guó)多個(gè)民族的文化，因此廣受人們的喜愛(ài)[1]。三角梅又稱葉子花，近10年來(lái)，三角梅陸續(xù)被海南和全國(guó)各地的幾十個(gè)城市選定為省花、市花[2]。三角梅具有很高的觀賞價(jià)值，但炭疽病的發(fā)生卻在一定程度上影響其正常生長(zhǎng)和美觀程度。較為常見(jiàn)的病害有三角梅炭疽病、葉斑病和枯梢病等[3]。當(dāng)前，對(duì)于三角梅炭疽病的報(bào)道僅停留在癥狀描述的層面，沒(méi)有清晰系統(tǒng)的癥狀、病原圖片，存在病原歸屬不準(zhǔn)確等問(wèn)題。本研究將系統(tǒng)描述三角梅炭疽病病原的分離與鑒定，從而為該病害的診斷和防治提供理論依據(jù)[4]。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

病原菌分離和接種均采用種植于福建農(nóng)林大學(xué)的紫色三角梅葉片。病原菌分離采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA），抗生素選用氨芐青霉素（Ampicillin）。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ?病組織切片法

摘取感病葉片，將葉片感病部位切成細(xì)葉絲，置于顯微鏡下觀察。

1.2.2? ?病組織分離法

1.2.2.1? 病原菌分離純化

摘取數(shù)片感病葉片，在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌操作，切下感病部位與健康部位交界處，約為5 mm×5 mm。將小葉塊浸入70%酒精中5 s、5%次氯酸鈉浸泡60 s，用滅菌水漂洗3遍，晾干后將小葉塊轉(zhuǎn)移至含氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基上放3個(gè)呈等邊三角形的小葉塊，均勻放在7 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，制作5皿。25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分離出多個(gè)單菌株。

1.2.2.2? 病原菌致病性測(cè)定

每個(gè)單菌株都進(jìn)行以下的平行試驗(yàn)：選取3片形態(tài)大小、生長(zhǎng)狀況盡量一致的健康葉片，其中2片葉用作病原菌接種，1片葉用作空白對(duì)照葉片。將葉片用無(wú)菌水沖洗干凈后再用70%乙醇擦拭一遍。用作接種的其中1片葉片用已滅菌的接種針在健康的葉片上于左上處和右下處2個(gè)接種點(diǎn)各針刺5下。從已分離到單株致病菌的培養(yǎng)基上切取菌絲塊（5 mm×5 mm），將生長(zhǎng)菌絲的一面放在刺傷的葉片傷口處，置于墊有浸濕濾紙的培養(yǎng)基內(nèi)保濕培養(yǎng)。另1片葉用從培養(yǎng)皿上洗脫收集的孢子懸浮液，濃度調(diào)至（1.0～2.0）×105個(gè)/mL后，均勻地噴灑在葉片上保濕培養(yǎng)。空白對(duì)照葉片放在另一個(gè)墊有浸濕濾紙的培養(yǎng)基內(nèi)保濕培養(yǎng)。于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察菌落并詳細(xì)記錄葉片的發(fā)病情況，非致炭疽病的菌株不發(fā)病或者表現(xiàn)出與初始病葉不同的病狀。選取和初始病狀一致的發(fā)病葉片對(duì)發(fā)病葉片繼續(xù)進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2.2.3? 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將致病菌株置于PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃條件下培育，定期觀察菌落并記錄菌落的形態(tài)特征和生長(zhǎng)狀況，挑取菌絲體及分生孢子在顯微鏡下觀察其形態(tài)。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?病害癥狀

病害主要發(fā)生在葉片上，病斑常常從葉尖或者葉緣開(kāi)始發(fā)生，初期呈現(xiàn)圓形黑色斑點(diǎn)，在斑點(diǎn)周?chē)鷷?huì)有黃色暈圈，緊接著會(huì)擴(kuò)大成圓形或不規(guī)則形的病斑;繼續(xù)擴(kuò)大后病斑會(huì)變干枯灰褐色，枯斑上會(huì)著生一輪一輪的同心狀小黑點(diǎn)，葉片上下都有著生;后期病斑會(huì)連成片，導(dǎo)致葉片無(wú)法生長(zhǎng)而脫落（圖1）。

2.2? ?病組織切片鑒定

將感病處小黑點(diǎn)切開(kāi)發(fā)現(xiàn)，小黑點(diǎn)為病原菌的分生孢子盤(pán)，盤(pán)內(nèi)密生分生孢子梗，無(wú)色，梗上頂生分生孢子1個(gè)。分生孢子兩端稍尖，直形或稍彎曲，單孢，無(wú)色（圖2）。符合膠孢炭疽菌的切片形態(tài)特征。

2.3? ?致病性測(cè)定

病菌分離培養(yǎng)得到3個(gè)培養(yǎng)性狀不同的菌株，分別對(duì)三角梅健康葉片進(jìn)行接種，只有1個(gè)菌株接種后發(fā)病，其余2個(gè)均未發(fā)病。這里認(rèn)為分離到的未使三角梅葉片發(fā)病的菌株可能為其他地方的病菌飄散至三角梅葉片上，并非導(dǎo)致三角梅炭疽病的病原。目標(biāo)菌株的孢子懸浮液接種的葉片7 d后開(kāi)始發(fā)病，菌塊接種的葉片和空白對(duì)照未出現(xiàn)發(fā)病癥狀。菌塊接種未能發(fā)病者，其原因可能為：孢子量較少、發(fā)病太慢或者未達(dá)到發(fā)病的初始菌量，也可能為接種菌塊的葉片抵抗病菌侵染的能力較強(qiáng)。孢子懸浮液致病的葉片7 d后葉緣處變枯黃，最終整片葉變灰褐色且葉緣處有小黑點(diǎn)的產(chǎn)生。從接種后的發(fā)病葉片上繼續(xù)分離病原物，再次獲得了病原菌的菌體形態(tài)和分生孢子形態(tài)，與最初分離物各項(xiàng)形態(tài)一致。再次回接至健康葉片后，葉片發(fā)病狀況與原始病葉一致。確定分離到的該菌為致病菌。

2.4? ?形態(tài)學(xué)鑒定

采用PDA培養(yǎng)基于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后菌落直徑2 cm左右，菌落邊緣整齊，氣生菌絲疏松，呈白色。培養(yǎng)5 d菌體中央變成淡黃色，后期逐漸變成橘紅色（圖3）。待氣生菌絲布滿培養(yǎng)皿時(shí)，中央菌絲體變?yōu)榛揖G色，且有表面油狀灰綠色堆狀物的出現(xiàn)。挑取堆狀物發(fā)現(xiàn)為分生孢子聚集而成，分生孢子呈橢圓形，單孢，無(wú)色，內(nèi)含2個(gè)油球（圖4）。符合膠孢炭疽菌的培養(yǎng)形態(tài)特征。

3? ?結(jié)論與討論

炭疽病是植物中常見(jiàn)的病害，寄主非常廣泛，在一些農(nóng)作物及果樹(shù)上容易發(fā)生，炭疽病的發(fā)生會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)量，若發(fā)生在觀賞植物上，則會(huì)降低其觀賞價(jià)值[4]。由于炭疽病菌是一種弱寄生菌，在植株健壯時(shí)并不容易侵染，加強(qiáng)栽培管理就是對(duì)植株進(jìn)行防護(hù)最重要的手段。三角梅喜溫暖濕潤(rùn)氣候，栽培方式多樣，盆栽式三角梅較易進(jìn)行防護(hù)管理。對(duì)于大規(guī)模露天栽培的三角梅來(lái)說(shuō)，連續(xù)的潮濕陰雨天容易發(fā)生炭疽病菌，在病害的侵染初期可以噴灑預(yù)防性藥劑，例如代鋅錳森、吡唑醚菌酯等。本研究明確了三角梅炭疽病的病原菌，有助于為該病害制定更有效、更具針對(duì)性的防治策略。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 徐夙俠，王亮生，舒慶艷，等.三角梅屬植物的生物學(xué)研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)，2008（4）：483-490.

[ 2 ] 吳淑梅.三角梅的養(yǎng)護(hù)技術(shù)及應(yīng)用初探[J].廈門(mén)科技，2002（4）：60-62.

[ 3 ] 陳楚戟.盆栽三角梅養(yǎng)護(hù)管理[J].中國(guó)花卉園藝，2015（14）：42-43.

[ 4 ] 韓長(zhǎng)志.膠孢炭疽病菌的研究進(jìn)展[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（S1）：386-389.