基于SSR的羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的分子鑒定及PCR檢測方法的建立

（銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300）

羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬圓線目、毛圓科、血矛屬線蟲，是一種呈世界性分布的寄生蟲。羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病由寄生在羊皺胃當(dāng)中的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲通過刺穿皺胃黏膜吸食血液引起。該病主要表現(xiàn)為貧血、消瘦等癥狀，有研究表明，100條成蟲每天可吸取約1.5 ml血液，羊嚴(yán)重感染時周圍內(nèi)成蟲可達(dá)上千條[1]。如養(yǎng)殖場管理不規(guī)范、環(huán)境控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的大規(guī)模爆發(fā)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的診斷主要依靠顯微鏡下觀察和辨認(rèn)糞便當(dāng)中的蟲卵來進(jìn)行確診，不但耗時費力，還需要有一定的蟲卵識別經(jīng)驗，準(zhǔn)確度較差。微衛(wèi)星DAN分子標(biāo)記（SSR）又稱簡單串聯(lián)重復(fù)序列，由1～6個核苷酸組成的重復(fù)單位構(gòu)成，序列片段多集中在100～300 bp之間。微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記特異性高、操作簡單，且對DNA質(zhì)量要求不高，對降解較嚴(yán)重的DNA也能擴(kuò)增出質(zhì)量較高的條帶，在臨床上具有更高的應(yīng)用價值，被廣泛應(yīng)用在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、動植物品種鑒定[2]等方面。

林海等利用ITS序列對林麝糞樣中的疑似血矛屬線蟲蟲卵進(jìn)行鑒定，通過BLAST比對和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定出其均為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲[3]。羅琴等同樣基于ITS序列對野生動物糞便中毛圓線蟲蟲卵進(jìn)行分子鑒定并建立了特異性PCR檢測方法[4]，陳武等[5]對長頸鹿捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲ITS序列進(jìn)行測定并進(jìn)行BLAST比對鑒定。以上均利用ITS序列在GENEBANK數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對達(dá)到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲或蟲卵鑒定的目的，因此實際應(yīng)用價值不高。利用微衛(wèi)星進(jìn)行物種鑒定在許多家畜及魚類上已有較廣泛的應(yīng)用，但捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的鑒定鮮有報道。本試驗篩選出兩組可靠的微衛(wèi)星引物用以對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的分子鑒定，為后期蟲卵鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲采自屠宰的貴州白山羊皺胃當(dāng)中，PBS反復(fù)沖洗蟲體以去除皺胃污染物，用0.9 %生理鹽水保存。血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司），2×PCR Mix（Takara，Premix Taq?（TaKaRa Taq?Version 2.0）），2×PCR Mix（Promega，GoTaq?Master Mixes），1.1×PCR Mix（北京擎科生物技術(shù)有限公司，1.1×T3 Super PCR Mix），DNA Marker（Takara，50 bp DNA Ladder （Dye Plus）），捻轉(zhuǎn)血矛線蟲微衛(wèi)星引物來自殷方媛文獻(xiàn)[6]，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 微衛(wèi)星引物信息

1.2 方法

將采集的若干條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲混合放入1.5 ml離心管中，并用剪刀剪碎成末狀，按基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。通過梯度PCR篩選引物并進(jìn)行組合，優(yōu)化二重PCR體系和條件，最終確定兩組可用于鑒定捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的PCR體系。PCR反應(yīng)體系為PCR Mix 5 μl，上下游引物各0.4 μl，DNA 0.5 μl，dd H2O 3.7 μl，總體積10 μl；PCR程序為95℃ 5 min，95℃ 30 S，退火溫度為梯度30 S，72℃ 30 S，72℃ 5 min，4℃保存。循環(huán)次數(shù)30次。3%瓊脂糖上樣。

2 結(jié)果

2.1 單重PCR體系的優(yōu)化

試驗設(shè)計5個退火溫度（62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃），分別用3對引物（Hcms 15、Hcms 36和Hcms 37）進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，Hcms 15引物和Hcms 37最佳退火溫度為62～58℃，Hcms 36引物在62～50℃范圍內(nèi)均可擴(kuò)增出較好的條帶。但引物Hcms 37出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增（大小在200～250 bp之間）。總體結(jié)果顯示，PCR條帶清晰，片段大小在預(yù)期范圍內(nèi)（見圖1）。

圖1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲微衛(wèi)星序列單重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M為DNA Marker ，1～5為引物Hcms 15，6～10為引物Hcms 36，11～15為引物Hcms 37。每組引物退火溫度依次為62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃。

2.2 二重PCR體系的優(yōu)化

試驗選取5個退火溫度（62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃），分別用3對引物進(jìn)行兩兩組合，對組合引物Hcms 15和Hcms 36、Hcms 15和Hcms 37、Hcms 36和Hcms 37進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，三個引物組合均擴(kuò)增出預(yù)期條帶，Hcms 36和Hcms 37組合由于片段大小相近，因此重合在一起不能分開。Hcms 15和Hcms 37組合由于受Hcms 37的非特異性擴(kuò)增的影響，仍有一條200～250 bp范圍的不清晰條帶（見圖2）。

圖2 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲微衛(wèi)星序列二重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M為DNA Marker ，1～5為引物Hcms 15和Hcms 36的組合，6～10為引物Hcms 15和Hcms 37的組合，11～15為引物Hcms 36和Hcms 37。每組引物退火溫度依次為62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃。

2.3 特異性檢測

對引物Hcms 15、Hcms36、Hcms 37及兩種組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增（退火溫度為62℃）。結(jié)果顯示，所有條帶均在預(yù)期片段大小范圍內(nèi)，單重PCR和二重PCR結(jié)果一致，符合預(yù)期結(jié)果。引物Hcms 15出現(xiàn)兩條亮度不一的條帶，但都在266～289 bp預(yù)期的范圍內(nèi)，符合微衛(wèi)星標(biāo)記的特點（見圖3）。

圖3 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲微衛(wèi)星序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性檢測

M為DNA Marker ，1～3為引物Hcms 15、Hcms 36和二者的組合，4～6為引物Hcms 15、Hcms 37和二者的組合，退火溫度均為62℃。

2.4 靈敏性檢測

依據(jù)優(yōu)化條件，對DNA樣品（濃度為400 ng/ μl）進(jìn)行20倍梯度稀釋。用Hcms 15和Hcms 36組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，二重PCR條帶在8號膠孔處仍可分辨出來，因此將最低檢測濃度定為2 ng/ μl（見圖4）。

圖4 PCR靈敏度試驗

M為DNA Marker。1～12號DNA濃度依次為：400 ng/μl、20 ng/μl、10 ng/μl、6.7 ng/μl、5 ng/μl、4 ng/μl、3 ng/μl、2.7 ng/μl 、2 ng/μl、1.3 ng/μl、1 ng/μL和0.8 ng/μl。

2.5 重復(fù)性檢測

用3個公司生產(chǎn)的3種PCR Mix對Hcms 15和Hcms 36、Hcms 15和Hcms37兩種組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，3種PCR Mix均能穩(wěn)定擴(kuò)增出目的條帶（見圖5）。

圖5 PCR重復(fù)性試驗

M為DNA Marker。1～3號引物Hcms 15、Hcms 36的組合，4～6為引物Hcms 15、Hcms 37的組合，退火溫度均為62℃。

3 討論

微衛(wèi)星分子標(biāo)記能很好地反映生物個體或種群間某種差異特征的DNA片段，是一種基于DNA片段長度多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)。目前，在作物上應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定的較多[7，8]，也有在寵物犬中利用微衛(wèi)星進(jìn)行品種鑒定[9]，但動物中應(yīng)用最多的仍是線粒體DNA片段或ITS序列等其他分子標(biāo)記。

單重和二重PCR在較大的溫度范圍內(nèi)均能擴(kuò)增出來產(chǎn)物，引物Hcms 37有非特異性擴(kuò)增，在提高退火溫度的同時，非特異性擴(kuò)增有所降低，不影響目的條帶的擴(kuò)增，且非特異性擴(kuò)增條帶的亮度遠(yuǎn)低于目的條帶，因此可作為標(biāo)記鑒定捻轉(zhuǎn)血矛線蟲。引物Hcms 15在片段大小范圍內(nèi)出現(xiàn)了兩條條帶，符合微衛(wèi)星標(biāo)記的特征，即微衛(wèi)星標(biāo)記是根據(jù)其兩側(cè)已知的保守序列進(jìn)行引物設(shè)計，擴(kuò)增產(chǎn)物包含微衛(wèi)星標(biāo)記序列在內(nèi)的片段，片段大小反映的是不同微衛(wèi)星標(biāo)記重復(fù)次數(shù)導(dǎo)致的多態(tài)性，為共顯性標(biāo)記[10]。因此，同一個體捻轉(zhuǎn)血矛線蟲也可出現(xiàn)兩條長度不同的片段，而本試驗所用到的DNA為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的混合DAN。

靈敏性檢測試驗表明，二重PCR可擴(kuò)增出濃度為2 ng/μl的DNA樣品。羅琴[4]等利用ITS區(qū)序列對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲DNA靈敏性檢測低至25.5×10-9ng/μl，遠(yuǎn)高于微衛(wèi)星的靈敏度。這可能與兩種分子標(biāo)記在蟲體內(nèi)的拷貝數(shù)量有關(guān)。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗建立的二重PCR檢測方法能有效避免捻轉(zhuǎn)血矛線蟲在糞便蟲卵檢查法中假陽性的出現(xiàn)，有一定的臨床實用價值。