子宮內(nèi)膜異位癥中錯(cuò)配修復(fù)基因1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與甲基化轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系*

單莉莉，何可人，溫佳琦，王中海

子宮內(nèi)膜異位癥中錯(cuò)配修復(fù)基因1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與甲基化轉(zhuǎn)移酶的關(guān)系*

單莉莉1，何可人1，溫佳琦1，王中海2*

（1. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與護(hù)理學(xué)院，廣東 深圳 518055；2. 華中科技大學(xué) 協(xié)和深圳醫(yī)院，廣東 深圳 510000）

為探討錯(cuò)配修復(fù)基因1（human mutL homolog 1，hMLH1）啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的關(guān)系，揭示子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）的可能病因，留取43例卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織納入EM組，留取30例其他婦科手術(shù)患者的正常子宮內(nèi)膜納入對(duì)照組．采用甲基特異性PCR（methylation specificity PCR，MSP）檢測(cè)2組標(biāo)本中hMLH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平．同時(shí)采用免疫組化SP法，檢測(cè)2組標(biāo)本中DNMT1和DNMT3a、DNMT 3b的表達(dá)．結(jié)果顯示，EM組甲基化率37%（16/43），對(duì)照組甲基化率3%（1/30），兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）．EM組DNMT1表達(dá)陽(yáng)性率為28%（12/43），對(duì)照組DNMT1表達(dá)陽(yáng)性率為3%（1/30），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）．甲基化的EM標(biāo)本中，DNMT1表達(dá)陽(yáng)性率為69%（11/16）；未甲基化的EM標(biāo)本中，DNMT1表達(dá)陽(yáng)性率為4%（1/27），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）．DNMT1高表達(dá)所致的hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化可能是子宮內(nèi)膜異位癥的病因之一．

子宮內(nèi)膜異位癥；hMLH1；甲基化；甲基化轉(zhuǎn)移酶

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）在育齡期女性中的發(fā)病率逐年升高，易造成不孕，影響女性生活質(zhì)量[1]．內(nèi)異癥病因目前尚不清楚，已有研究證實(shí)：hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是內(nèi)異癥的可能病因，與國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者的研究結(jié)果一致[2]．甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）是DNA甲基化的關(guān)鍵酶，與DNA甲基化活性有密切關(guān)系．本項(xiàng)研究提取內(nèi)異癥組織中的DNA，用甲基特異性PCR（methylation specificity PCR，MSP）檢測(cè)組織中錯(cuò)配修復(fù)基因1（human mutL homolog 1，hMLH1）啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平；采用免疫組化SP法，檢測(cè)內(nèi)異癥組織中DNMT1和DNMT3a、DNMT3b的表達(dá)，同時(shí)用正常子宮內(nèi)膜組織做對(duì)照，探討內(nèi)異癥中hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與DNMT的關(guān)系，揭示內(nèi)異癥的可能病因．

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

選擇2018年6月至2019年1月華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院收治的卵巢子宮內(nèi)膜異位癥病人43例，年齡為26~45歲，無(wú)其他并發(fā)疾病，留存卵巢的異位內(nèi)膜組織．同期，在該院行其他婦科手術(shù)（主要為子宮脫垂手術(shù)或節(jié)育術(shù)）的病人30例，年齡29~38歲，無(wú)其他并發(fā)疾病，留存正常子宮內(nèi)膜組織．

1.2 方法

1）采用小量組織基因組DNA抽提試劑盒提取組織DNA，設(shè)計(jì)并合成了hMLH1甲基化引物（hMLH1-m）和非甲基化引物（hMLH1-u），采用MSP檢測(cè)組織中hMLH1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察．

2）采用免疫組化SP法檢測(cè)組織中DNMT1、DNMT3a、DNMT 3b的表達(dá)，DNMT陽(yáng)性出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜腺上皮的胞漿中，呈黃棕色沉淀．隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野（×400），觀察黃棕色沉淀所占比例，取5個(gè)高倍鏡視野平均值，≥10%為陽(yáng)性，＜10%為陰性．

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05示差異有顯著意義．

2 結(jié) 果

2.1 hMLH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

43例內(nèi)異癥組織中，16例出現(xiàn)甲基化（m），27例出現(xiàn)未甲基化（u），甲基化率37%．30例正常子宮內(nèi)膜組織中，1例出現(xiàn)甲基化，甲基化率3%．見(jiàn)表1，圖1-3．兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）

表1 hMLH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

圖1 對(duì)照組DNA hMLH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化

1、2、3、9、10、11號(hào)部分甲基化；4、5、6、12、13、14、15、16、19、20號(hào)完全甲基化，7、8、17、18、21-43號(hào)未甲基化

18號(hào)部分甲基化，其余全部未甲基化

2.2 DNMT1、DNMT3a、DNMT 3b的表達(dá)

內(nèi)異癥組與正常子宮內(nèi)膜組均未檢測(cè)到DNMT3b的表達(dá)．內(nèi)異癥組中，DNMT3a表達(dá)陽(yáng)性2例，表達(dá)陽(yáng)性率為5%（2/43例），正常子宮內(nèi)膜組中，DNMT3a表達(dá)陽(yáng)性1例，表達(dá)陽(yáng)性率為3%（1/30例），兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）．內(nèi)異癥組中，DNMT1表達(dá)陽(yáng)性12例，表達(dá)陽(yáng)性率為28%（12/43例），正常子宮內(nèi)膜組中，1例DNMT1表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)陽(yáng)性率為3%（1/30例），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）（表2、圖4、圖5）．

2.3 內(nèi)異癥中DNMT1、DNMT3a的表達(dá)

16例hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的內(nèi)異癥中，11例DNMT1表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)陽(yáng)性率為69%；27例hMLH1啟動(dòng)子區(qū)未甲基化的內(nèi)異癥中，1例DNMT1表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)陽(yáng)性率為4%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）．16例hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的內(nèi)異癥標(biāo)本中，1例DNMT3a表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)陽(yáng)性率為6%；27例hMLH1啟動(dòng)子區(qū)未甲基化的內(nèi)異癥標(biāo)本中，1例DNMT3a表達(dá)陽(yáng)性，表達(dá)陽(yáng)性率為4%，兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）．其中，1例異常甲基化標(biāo)本DNMT1、DNMT3a同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性（見(jiàn)表3）．

表2 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在內(nèi)異癥及正常內(nèi)膜中的表達(dá)

圖4 DNMT1在內(nèi)異癥組織中表達(dá)陽(yáng)性（SP×400）

圖5 DNMT1在正常內(nèi)膜組織中表達(dá)陰性（SP×400）

表3 DNMT1、DNMT3a在內(nèi)異癥中的表達(dá)

3 討 論

人類基因組錯(cuò)配修復(fù)反應(yīng)可修復(fù)DNA復(fù)制中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配、消除不配對(duì)序列，從而防止DNA復(fù)制差錯(cuò)的發(fā)生．錯(cuò)配修復(fù)基因（mismatch repair gene，MMR）與錯(cuò)配修復(fù)反應(yīng)有密切關(guān)系，hMLH1是MMR中最重要的成員，國(guó)內(nèi)外很多研究已證明，hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化導(dǎo)致的hMLH1表達(dá)缺陷，在結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、直腸癌、胃癌等的發(fā)生過(guò)程中起重要作用[3-5]．內(nèi)異癥屬于婦科良性疾病，卻具有浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等惡性腫瘤的特點(diǎn)，已有研究證實(shí)：hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化導(dǎo)致的hMLH1表達(dá)缺陷可能是內(nèi)異癥的病因之一[6]．本次研究結(jié)果進(jìn)一步支持了上述論斷，內(nèi)異癥組織與正常子宮內(nèi)膜組織比較，hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的發(fā)生率更高．

DNA甲基化需要DNMT的催化，已有研究證明，主要有3種DNMT參與DNA甲基化過(guò)程．DNMT3a、DNMT3b的主要功能是參與DNA從頭甲基化，對(duì)未甲基化DNA的親和力及生物活性更高，DNMT3a、DNMT3b將未甲基化的位點(diǎn)進(jìn)行甲基化，建立新甲基化．DNMT1的主要功能是參與DNA甲基化狀態(tài)的維持，對(duì)于半甲基化DNA的親和力及生物活性更強(qiáng)，催化復(fù)制后DNA子鏈的甲基化，使其保持與親鏈相同的甲基化狀態(tài)．本研究提示，內(nèi)異癥組織中存在DNMT1的高表達(dá)，hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化與DNMT1的高表達(dá)密切相關(guān)，與DNMT3a、DNMT3b無(wú)關(guān)．這一研究結(jié)果提示：DNMT1高表達(dá)所致的hMLH1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化可能是子宮內(nèi)膜異位癥的病因之一．

研究表明，甲基化轉(zhuǎn)移酶的過(guò)度表達(dá)可以作為DNA甲基化的重要指標(biāo)．很多內(nèi)異癥病人沒(méi)有臨床癥狀，能否通過(guò)DNMT1表達(dá)的監(jiān)測(cè)，協(xié)助內(nèi)異癥診斷；內(nèi)異癥治療后的復(fù)發(fā)問(wèn)題，一直困擾著婦科醫(yī)生，能否通過(guò)監(jiān)測(cè)DNMT1的表達(dá)，預(yù)警內(nèi)異癥復(fù)發(fā)，可作為我們未來(lái)的研究方向．已有學(xué)者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明：采用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，抑制甲基轉(zhuǎn)移過(guò)程，進(jìn)行基因靶向治療，對(duì)疾病的治療有重要作用[7，8]．2006年在美國(guó)上市的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑—地西他濱（Decitabine，DacogenTM）和阿扎胞苷（Azacitidine，VidazaTM）已用于治療骨髓異常增生綜合征（myelodysplasia syndrome，MDS），該藥物可通過(guò)抑制基因異常甲基化而在基因水平治療MDS．目前學(xué)界認(rèn)為，EM是一種表觀遺傳學(xué)疾病，而表觀遺傳修飾是一種可逆性的修飾，未來(lái)，能否在臨床應(yīng)用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，通過(guò)抑制基因異常甲基化而治療內(nèi)異癥，尚待進(jìn)一步研究．

[1] 謝幸，孔北華，段濤，等．婦產(chǎn)科學(xué)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2018．

[2] Saare M, Krigul K L, Laisk-Podar T, et al. DNA methylation alterations-potential cause of endometriosis pathogenesis or a reflection of tissue heterogeneity[J]., 2018，99（2）：273-282．

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[8] 張婷，夏良斌，高靜，等．DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑對(duì)子宮內(nèi)膜異位灶的影響[J]．實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2016，32（1）：57-62．

The Relationship between the DNA Methyltransterase and the Methylation of Human MutL Lomolog 1 Promoter in Endomrtriosis

SHAN Lili1, WEN Jiaqi1, WANG Zhonghai2

（）

This paper is to study the relationship between the methylation of human mutL homolog 1(hMLH1) promoter and the DNA methyltransterase (DNMT), and the relationship between DNMT and endometriosis(EM). Methylation of hMLH1 promoter was verified by methylation specificity PCR(MSP) and the protein expression of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b was analysed by the immunohistochemistry SP method in 43 tissues of endometriosis and 30 tissues of normal endometrium. Results show that there was significant difference between two groups(＜0.05). First, the hMLH1 promoter methylation in endomrtriosis was 37%(16/43), while in control group was 3%(1/30). Second, the protein expression of DNMT1 in endomrtriosis was 28%(12/43), while in control group was 3%(1/30).Third, the protein expression of DNMT1 in endomrtriosis with methylation of hMLH1 promoter was 69%(11/16), while the protein expression of DNMT1 in endomrtriosis without methylation of hMLH1 promoter was 4%(1/27). The high expression of DNMT1 with high methylation of hMLH1 promoter may be one of the mechanisms of endometriosis.

endomrtriosis; triosishuman mutL homolog 1(hMLH1); methylation; methyltransferase inhibitou

2020-05-25

深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)自然科學(xué)類重點(diǎn)資助項(xiàng)目（601822K31007）

單莉莉，女，吉林人，醫(yī)學(xué)博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要研究方向：子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制．

王中海，男，安徽人，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制的研究、婦科微創(chuàng)手術(shù)技術(shù)．

R711.71

A

1672-0318（2020）05-0047-05

10.13899/j.cnki.szptxb.2020.05.009