QuEChERS-超高效液相色譜法測定蜂蜜中升華硫

中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093

小蜂螨，又稱小螨，是熱厲螨屬蜜蜂寄生螨，是我國養蜂業面臨的主要蟲害之一[1]。小蜂螨寄生在巢房中，以蜂幼蟲的血淋巴為食，可導致蜜蜂封蓋幼蟲、蜂蛹衰弱、發育不良、無法羽化，甚至死亡。從而致使蜂群群勢減弱，嚴重者會導致全群消亡[2]。小蜂螨個體小、繁殖迅速[3]，對中、西方蜜蜂均有嚴重危害，在我國小蜂螨危害性高于大蜂螨[4]。

目前，小蜂螨的防治方法主要有：化學藥物、生物防控和物理方法。我國蜂農防治小蜂螨主要以化學藥物為主，包括甲酸、升華硫、雙甲脒以及菊酯類藥物。其中升華硫因具有低毒、高效、價格低廉等特點，已成為目前我國養蜂生產中使用最廣泛的防治小蜂螨藥物[5]。蜂農通過在蜂箱中撒施、紗布袋落粉、涂抹封蓋的子脾、隔王板噴涂、置升華硫粉盒等方法進行施藥[6]。由于施藥期間，升華硫可通過藥物噴灑、蜜蜂攜帶、升華等途徑污染巢脾，造成蜂產品中升華硫污染等問題。

我國食品安全國家標準《GB 2760-2014 食品添加劑使用標準》中規定硫磺最大使用量應在0.1 g/kg（水果干類、食糖）～ 0.9 g/kg（魔芋粉）。目前檢測硫磺的方法主要有滴定法、硫酸鋇重量法和碘量法等。《GB 3150-2010 食品添加劑 硫磺》通過扣除樣品中雜質（灰分、酸度、有機物和砷）的質量分數，來計算硫磺中硫的質量分數，該方法不適宜測定復雜樣品中低濃度的升華硫殘留。《中國藥典》（2005年版和2010年版）采用燃燒-滴定的方法對升華硫含量進行測定，對于水分含量高、基質較為復雜的蜂蜜并不適用。隨著色譜技術的發展，已有文獻報道采用液相色譜技術對中藥硫磺[7]、湖泊沉積物[8]等樣品中升華硫進行測定。本文基于上述工作，采用QuEChERS 前處理方法和超高效液相色譜（UPLC）檢測技術建立了蜂蜜中升華硫殘留的簡單、快速、高效檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 標準品與試劑：升華硫（純度≥99%）購買于Alfa Aesar（美國）；乙酸乙酯、甲醇，色譜純，購買于Fisher Scientific（美國）；無水硫酸鈉（分析純）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA，40 μm～60 μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，40 μm～60 μm）購買于安捷倫公司（美國）。試驗用水均為超純水。

1.1.2 主要儀器：超高效液相色譜儀（UPLC）配有二極管陣列檢測器（DAD）（waters，美國），ACQUITY CSH C18 色譜柱（2.1×100 mm，1.7 μm）；分析天平（萬分之一天平，梅特勒-托利多，上海）；高速離心機（CR22G Ⅱ，日立，日本）；超純水儀（Integral5，Milli-Q，美國）。

1.2.3 溶液配制：準確稱取升華硫標準品10 mg，用乙酸乙酯溶解，配制成100 μg/ml的標準儲備液。準確移取適量升華硫標準儲備液用乙酸乙酯稀釋成濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 μg/ml的標準工作液，供液相色譜儀測定。以升華硫峰面積為縱坐標，標準工作液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求回歸方程和相關系數。

1.2 液相色譜條件

流動相：甲醇-水（95：5，v/v）；流速：0.3 ml/min；檢測波長：254 nm；進樣量：2 μl；柱溫：30℃。液相色譜圖見圖1。升華硫出峰時間為2.540 min，色譜圖中第一個峰為溶劑峰。

圖1 升華硫液相色譜圖（4.0 μg/ml，出峰時間：2.540 min）

1.3 樣品前處理方法

稱取蜂蜜樣品5.0 g 于50 ml 具塞塑料離心管中，加入5 ml 水，渦旋震蕩2 min，使蜂蜜充分溶解；加入10 ml 乙酸乙酯，渦旋振蕩10 min，于4℃下8000 r/min 離心5 min。取上清液5 ml 于15 ml 具塞離心管中，加入150 mg C18、50 mg PSA 和900 mg Na2SO4，渦旋振蕩1 min，于4℃下8000 r/min 離心5 min。取上層清液1 ml,經0.22 μm PTFE 濾膜過濾后待測。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑和吸附劑的選擇

升華硫能夠溶于二硫化碳、四氯化碳、三氯甲烷、甲苯、苯、乙酸乙酯等，微溶于乙醇和甲醇，不溶于水。根據文獻報道，乙酸乙酯、甲醇均可有效提取升華硫[7,8]。但由于甲醇與水互溶，在本實驗中無法作為提取溶劑，因此選用乙酸乙酯作為提取溶劑。

C18 和PSA是QuEChERS 方法最常使用的吸附劑。蜂蜜主要含有糖（80%）以及少量蛋白質、脂肪、氨基酸等。C18 具有去除脂肪的功能，PSA 可以吸附蜂蜜樣品提取液中的糖、脂肪酸、有機酸、酯類等干擾物[9]。因此選用C18+PSA 吸附劑組合，并參考獸藥殘留檢測常用劑量（50 mg C18，150 mg PSA）[10]，對蜂蜜樣品基質進行凈化，減少干擾。

2.2 檢測波長的選擇

對升華硫標準溶液在200～400 nm 波長范圍內進行掃描，升華硫在254 nm 處吸收值較高且干擾較少，因此選用254 nm 作為最終檢測波長。

2.3 線性范圍、方法檢出限和定量限

標準工作液：分別量取適量標準儲備液，用乙酸乙酯配制濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/ml的系列標準工作液，依次從低濃度到高濃度依上述色譜條件進液相色譜測定，將所得峰面積的平均值與所對應的標準溶液濃度做線性回歸，結果顯示升華硫在0.1～10 μg/ml 濃度范圍內呈線性關系：y=10375.2X+72.4 （見圖2）；線性相關系數r2=0.9996。

圖2 升華硫標準曲線

通過分析5個空白樣品，以3倍信噪比計算，得到該方法檢出限（LOD）為0.1 μg/ml；以10倍信噪比計算，得到該方法定量限（LOQ）為0.3 μg/ml。該方法檢出限和定量限低于食品安全國家標準《GB 2760-2014 食品添加劑使用標準》中規定硫磺最大使用量的最低值（0.1 g/kg）。

2.4 方法回收率和精密度

為考察方法的準確度和精密度，進行了的添加回收試驗。按照上述處理和測定方法，選擇空白蜂蜜樣品，添加4個不同濃度（即0.4 mg/kg、1.0 mg/kg、4.0 mg/kg、8 mg/kg），每個水平設5個平行。測定結果見表1。本方法在四個添加濃度水平回收率在75.0%～95.8%之間，批次內RSD為1.01%～2.62%，批次 間RSD為3.79%～4.75%。方法準確度和精密度能夠滿足檢測要求。添加樣品和空白樣品色譜圖見圖3。

圖3 添加樣品（4.0 mg/kg）和空白樣品色譜圖

表1 回收試驗結果

3 結論

本文建立了蜂蜜中升華硫殘留的超高效液相色譜檢測方法。采用純水溶解蜂蜜，乙酸乙酯提取，離心去除雜質，經C18和PSA凈化，高效液相色譜儀檢測，以水和甲醇為流動相進行等度洗脫分離，全部檢測流程僅需30 min。本方法的準確度、精密度和靈敏度均經過方法學評價，滿足殘留檢測的要求。相比于“燃燒-滴定法”、“重量法”，QuEChERS-超高效液相色譜法更加快速、簡便，適用于檢測復雜樣品基質中低殘留量的升華硫。