杜鵑組培微枝試管外生根影響因素研究

王愛芝 王清君 劉運偉

摘要： ?對杜鵑組培微枝試管外生根影響因素研究的結果表明，基質類型、基質處理方法、基質含水率、生長調節劑均對生根率有很大影響。在杜鵑無菌莖芽增壯培養基中添加0.8 μmol/L的2-ip培養7～8周，用300 mg/L的GGR速蘸莖芽基部，扦插在均勻拌入菌蟲雙殺0.84 g/L的純草炭土中（pH值5.8，含水率75%），在室內組培馴化室進行試管外生根可得到較好的生根效果。

關鍵詞： ?杜鵑; ?組織培養; ?微枝; ?試管外生根

中圖分類號： ? S 722. 3 + 7， ?S 685. 21 ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼： ? A ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1001 - 9499（2020）02 - 0010 - 04

杜鵑（Rhododendron）是杜鵑花科植物中種類最多的一個屬，原產于北美洲、西歐和北亞，目前共發現1 000多種[ 1 ]。杜鵑的花期長，從冬末到初夏皆可開花，且花色種類豐富，被廣泛用作風景林地的觀賞植物。此外，杜鵑還具有環境監測功能，可以作為NO和NO2等氣體的敏感監測樹種[ 2 ]。我國從20世紀80年代開始進行杜鵑組織培養的研究，并取得了一定進展。楊乃博等以毛葉杜鵑葉片為外植體培養得到再生植株[ 3 ];有的學者用組培苗的葉片作為外植體進行誘導獲得成功[ 4 ];鐘宇對西洋杜鵑的莖尖進行培養獲得成功[ 5 ];程雪梅對馬纓杜鵑的莖尖、莖段、葉片、根等進行組織培養，以建立其快繁技術[ 6 ];宋慧娟和莊雪影對毛棉杜鵑的組織培養條件進行優化[ 7 ];吳影倩等對2種杜鵑雜交種不定芽生根培養基配方進行了優化[ 8 ]。目前，我國已經初步建立了杜鵑組培快繁體系，但杜鵑品種間的差別大、莖葉等外植體消毒難、不定芽分化率低、優良品種生根困難和移栽成活率低等問題，仍是杜鵑花組織培養中急需研究和解決的問題。

試管外生根技術是杜鵑組織培養難題的突破口，它將組培莖芽的生根誘導和馴化培養兩個過程合二為一，即直接將無菌莖芽扦插到試管外有菌環境中，在誘導生根的同時進行馴化培養[ 9 ]。目前，以頂芽和腋芽為外植體大量繁殖杜鵑無根莖叢的技術已經成形[ 10 - 15 ]。為了縮短育苗周期，降低生產成本，在短期內得到大量健壯的杜鵑苗，本研究以經壯苗培養的杜鵑無根莖叢為材料，扦插在不同基質上，通過控制基質的含水量和培養條件，找到影響杜鵑試管外生根的主要因素和適合杜鵑試管外生根的最佳條件，進而生產大量苗木以滿足日益增大的市場需求，為杜鵑實現產業化生產提供更廣泛的理論和實踐基礎。

1 試驗材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料為從美國引進的杜鵑雜交種最佳組培系10瓶，品種為Rhododendron'western's Prink Diamond'，是R. dauricum×R. minus×R. mucronatum的雜交種。該杜鵑品種生長旺盛，早春開花，花粉色雙邊，鈴鐺狀花形;冬季半數葉片呈綠色，其余葉片呈紅褐色。該品種兼具有幾個親本的優良特性，可在一定程度上克服杜鵑適應性及抗寒性差的缺陷。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 杜鵑無菌莖芽增壯培養

做無菌莖芽增壯培養時，將杜鵑莖芽從培養瓶中取出，去葉至頂芽處留3～4片小葉。將頂芽剪下并垂直接種到培養基中，剩余部分則剪成1.0～1.5 cm長的莖段，水平接種在培養基上。將杜鵑頂芽和莖段分別接種，每個瓶中接種10個外植體。增壯培養基為：WPM+蔗糖25 g/L+瓊脂7 g/L，添加不同濃度的細胞分裂素2-ip（0 μmol/L和0.8 μmol/L），pH值5.8。采用日光燈照射，進行光照培養，每天22 h光照/2 h黑暗或全光照培養，溫度25±2 ℃，濕度70%～80%。培養7周后，調查0 μmol/L和0.8 μmol/L濃度2-ip對杜鵑莖芽質量的影響，測定苗高和半木質化的外植體數，然后進行組培莖叢微枝扦插。

1. 2. 2 杜鵑組培莖叢微扦插

在事先澆好水的移栽基質上均勻打出約1.5 cm深的小孔，為了保證生根一致，將杜鵑試管苗去葉至頂芽處保留4～6片葉子，得到約3 cm高的莖芽。將小苗插入基質的孔中，壓實后在葉面上噴水蓋上蓋子培養。培養在25 ℃左右，濕度60%～70%，每天光照16 h/黑暗8 h的培養室中。微扦插時，瓶苗從無菌狀態的高溫、高濕、弱光的環境過渡到有菌狀態的自然條件，為了適應微扦插后的較低濕度以及較強的光照，需先將無菌芽放到煉苗室內煉苗3～7 天。

1. 2. 3 杜鵑無菌莖芽試管外生根

移栽基質的種類和組分決定了該基質的特性，并對無根苗的生根和生長造成直接影響。根據杜鵑喜酸的特性，本試驗選用5種移栽基質扦插杜鵑組培莖芽，分別為購自昆明的粗草炭土、購自昆明的細草炭土、購自黑龍江省朗鄉林業局的草炭土、購自黑龍江省朗鄉林業局的草炭土與沙子等比例混合、純沙子，將基質分裝在培養盒內，基質至盒身高度的3/5處，將其壓實，澆水待移栽。按照土壤pH值的測定方法[ 15 ]，測定5種移栽基質的pH值和含水量。按照試驗設計開展以下試驗：（1）移栽基質試驗。在5種基質中進行微扦插培養，每個處理最少130株，設3次重復;培養8周后，調查平均生根率，篩選出最佳移栽基質。（2）基質處理方法試驗。采用不同方法處理最佳基質，一是在基質中按比例攪拌菌蟲雙殺（山東省青州市日中經貿有限公司生產）0.84 g/L，二是對基質進行高溫滅菌，三是不處理，每個處理40株，設3次重復;培養8周后，調查平均生根率，篩選出最佳基質處理方法。（3）基質含水率試驗。設4種不同含水率，水體積與基質體積之比分別為3∶20，4∶20，5∶20和6∶20，每個處理120株，3次重復。培養6周后，調查試管外生根率和苗高增長量，確定基質最佳含水率。（4）生長調節劑試驗。基于以上3項試驗得到的最佳基質配置，采用NAA、IBA、ABT1、ABT2和GGR等5種生長調節劑，每種均采用50、100、200和300 mg/L4個水平，每個處理設3次重復，用速蘸法進行微枝扦插，培養8周后，調查試管外生根率、苗高、地徑、根數和根長等指標。

2 結果與分析

2. 1 壯苗期2-ip濃度對杜鵑莖芽質量的影響

由不同2-ip濃度對杜鵑莖芽質量的影響（表1）可以看出，壯苗期間添加不同濃度的2-ip，對杜鵑莖芽的生長和增殖影響存在差異。添加0.8 μmol/L 2-ip的無根莖芽，不論是平均苗高還是半木質化百分率，均優于未添加2-ip的處理，因此應在培養基中添加0.8 μmol/L 2-ip。

2. 2 移栽基質對杜鵑組培莖芽試管外生根的影響

據測定，昆明和朗鄉純草炭的pH值均呈酸性，沙子的pH值則接近中性，朗鄉草炭和沙子等比例混合的基質pH值居于二者之間。在不同基質中微扦插培養8周后，調查試管外生根率。由不同移栽基質對杜鵑試管外生根率的影響（表2）可以看出，以純沙子為基質，試管外生根率為8.1%，推測其不適合杜鵑試管外生根;用草炭和沙子為基質，生根率為10.9%;在昆明粗草炭和細草炭2種基質上進行微扦插的杜鵑無根苗，死亡率分別為7.9%和5.4%，雖然死亡率不高，但最終生根率只達到57.4%和40.0%，所以也不是杜鵑試管外生根最佳的移栽基質;在朗鄉草炭土上微扦插苗的死亡率僅為9.2%，且平均生根率也最高，說明黑龍江省朗鄉草炭土較適合杜鵑無根苗試管外生根。由此可知，購自黑龍江朗鄉pH值為5.82的草炭土作為基質最適于杜鵑試管外生根。

2. 3 基質處理方法對杜鵑莖芽試管外生根的影響

由不同基質處理方法對杜鵑試管外生根率的影響（表3）可以看出，在攪拌菌蟲雙殺0.84 g/L的草炭土基質中微扦插苗平均生根率最高，達到了91.7%;在經過高溫滅菌的草炭土基質中的平均生根率為85.0%;在未經任何處理的草炭土基質中的平均生根率只有27.5%。造成生根率過低的原因可能是扦插前基質中含有大量細菌和微生物，杜鵑無根莖芽受到雜菌污染所致。由此可知，攪拌菌蟲雙殺0.84 g/L的草炭土操作快捷簡單，又非常有效。

2. 4 基質含水率對杜鵑試管外生根的影響

由不同含水率基質對杜鵑試管外生根的影響（表4）可以看出，基質的含水率對莖芽試管外生根及小苗生長影響很大，水分過多或過少都對苗的生長產生不利影響。水體積與草炭土體積比分別為3∶20，4∶20，5∶20和6∶20時，對杜鵑試管苗的生根率和平均苗高增長量的影響呈現先增加后降低的趨勢。可見，基質含水率過高和過低都不適合杜鵑無根苗的生根和生長，基質中水體積與草炭土體積比為5∶20（含水率75%）時，比較適合杜鵑試管外生根和苗高生長。

2. 5 生長調節劑對杜鵑莖芽試管外生根的影響

由生長調節劑對杜鵑試管外生根及生長情況的影響（表5）可以看出，NAA在各試驗濃度的生根率隨著濃度的增加呈上升趨勢，但平均生根率均小于50%;IBA和ABT1在試驗濃度范圍內生根率均小于30%;ABT2和GGR較前三者生根率較高，其中當ABT2濃度為50 mg/L時，生根率可達86.4%，GGR對其生根率的影響效果最顯著，隨著濃度的增加而不斷升高，在300 mg/L時生根率達最大值88.6%。

5種生長調節劑對平均根數和平均根長的影響結果差別不明顯，平均根數大部分集中在2～4條。GGR在各試驗濃度時根數多數為3或4條，其中最多根數有6條，最少的有2條。5種生長調節劑對根長的影響順序為：IBA>GGR>ABT2>NAA>ABT1;同時，試管外生根苗的苗高受生長調節劑種類和濃度的影響各不相同，除了ABT1處理外，苗高均能達到4～5 cm;ABT2在試驗濃度范圍內濃度的平均苗高均大于5 cm，GGR在各濃度平均苗高也達到4 cm左右。此外，生長調節劑種類對地徑的影響順序為：GGR>ABT2>IBA>NAA>ABT1。由此可知，在經過GGR和ABT2處理后，幼苗的苗高和地徑優于其它3種生長調節劑處理。

經試驗，各種濃度的ABT1處理對試驗各項指標的效果都不好，ABT2和GGR處理后的生根情況較其它3種生長調節劑好。綜合考慮杜鵑莖芽試管外生根率、根數、根長、苗高和地徑等指標，300 mg/L GGR處理的杜鵑苗生根率最高達88.6%，苗高可達4.91 cm，地徑最粗為0.65 mm，最多根數可達6條，平均根長為1.00 cm。因此，用300 mg/L GGR速蘸莖芽基部是杜鵑試管外生根的最佳處理。

3 結論與討論

3. 1 采用引進的杜鵑瓶苗，經多次增殖培養，出瓶前經過增壯培養（添加2-ip 0.8 μmol/L的WPM培養基）7～8周，瓶苗出瓶前閉瓶煉苗3～7天（溫度為25 ℃左右，濕度為60%～70%，以日光燈照射，較強的光照條件）。扦插時，將杜鵑無根莖芽剪成單株，用生長調節劑GGR以300 mg/L速蘸其基部，然后扦插在事先處理好的純草炭土，拌入菌蟲雙殺0.84 g/L，pH值5.8左右，含水率75%左右，在室內組培馴化室進行試管外生根培養，可得到較好的生根效果。

3. 2 進行杜鵑組培微枝試管外生根試驗時應注意：在生根期間，每天早晚打開蓋子通風，用水噴灑葉面，根據基質的干濕情況進行澆水，始終保證基質潮濕。杜鵑生根很慢，通常1個月后才會有3%～5%的莖叢長根，大部分到6～8周才會陸續生根，逐漸用小鑷子將盒蓋支起，不斷增加光照直到把盒蓋完全撤去。生根期間如果基質的濕度過大，1個月后基質表面就會長綠苔，但如果開蓋，基質很快會干，沒有生根的幼苗會隨之干枯，所以控制基質的濕度十分關鍵。另外，要逐漸增加光照和通風時間，一般4周后幼苗逐漸長出新葉，生根率在80%以上，幼苗葉片翠綠，莖粗壯。

3. 3 不同種類和濃度的生長調節劑對杜鵑試管外生根率的影響并不規律，造成這種現象的原因可能是杜鵑組培莖芽本身木質化程度低，用生長調節劑處理后基部組織受到損傷，不能正常吸收水分和養分，分化根原基進而分化成根，導致扦插后不久有死苗現象。另外，扦插后的管理也很重要，如基質含水率控制不嚴格也可能造成影響不規律。

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第1作者簡介： ?王愛芝（1975-）， ?女， ?博士， ?助理研究員， ?主要從事種苗培育原理與技術的研究工作。

通訊作者： ?沈海龍（1962-）， ?男， ?博士， ?教授， ?博士生導師， ?主要從事森林培育學的教學和科研工作。

收稿日期： 2020 - 01 - 20

（責任編輯： ? 王 巖）

Abstract The results of research on influencing factors of Micro-cuttings Ex-vitro rooting of Rhododendron tissue culture showed that substrate type， substrate treatment method， substrate moisture content， and growth regulators all have a great effect on rooting rate. Add 0.8 mol/L of 2-ip to the sterile growth of rhododendron culture for 7～8 weeks. Quickly dip the base of the stem bud with 300 mg / L GGR， and cut into 0.84 g / L of double-killed bacteria pure peat soil （pH value of 5.8 and water content of 75%） ） can be better rooted when cultivated in an indoor tissue culture and domestication room for external rooting.

Key words Rhododendron; ?Tissue culture; ?Micro-cuttings; ?Ex-vitro Rooting