基于改進移動窗口目標轉化因子分析的多農藥殘留自動化定性分析方法

楊清華，李尚科，劉霞，蔣立文，李跑，2，*

（1.湖南農業大學食品科學與技術學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；2.湖南省農業科學院湖南省農產品加工研究所，湖南長沙410125）

隨著人民生活水平的不斷提高，食品安全越來越受到關注，尤其是果蔬中多農藥殘留問題是關注的焦點[1-2]。食品中多農藥殘留的危害極大，輕則引起食物中毒，嚴重可導致癌癥、胎兒畸形等[3-5]。目前最常見的農藥殘留檢測方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[6]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7]、氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8]、液相色譜-質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）[9]等。色譜法靈敏度高，但易受基質的影響；色譜聯用技術在質譜的幫助下能使組分的定性更加快速和可靠，然而依舊較難實現對復雜基質樣品中多農藥殘留的快速自動化定性分析。此外，現如今大多數檢測方法僅僅是對樣品中已知存在的農藥進行檢測。Li等[10]建立一種蔬菜中三唑類殺菌劑（triazole fungicides，TFs）的磁固相萃取-氣相色譜-火焰離子化檢測器（magnetic solid phase extraction-gas chromatographyflame ionization detector，MSPE-GC-FID）檢測方法，該方法對5種TFs都有良好的線性范圍。然而此方法中磁性多孔有機聚合物的合成要經過偶氮反應，對萃取時間、pH值、離子強度、吸附劑用量、樣品體積和洗脫液進行優化后才能實現TFs的準確分析，該方法步驟繁瑣，操作復雜，不適合多組分樣品的分析。張秀豐等[11]采用改進快速樣品前處理技術為前處理方法，利用GCMS儀器實現對茶葉中毒死蜱、聯苯菊酯等農藥殘留的檢測，結果在0.01 mg/L～3.00 mg/L顯示出良好的線性關系，此方法GC-MS檢測消耗時間長，也不適合多組分快速無損檢測。

由于食品中樣品基質的復雜性，在分析信號中易出現色譜峰重疊以及噪聲干擾等現象，導致樣品中農藥殘留無法準確檢測，而化學計量學對復雜信號中組分信號的提取以及背景噪聲的扣除都有著非常好的作用[12-16]?；瘜W計量學自動化解析可以縮短試驗時間、減少有毒有害試劑的使用，還可以對多種農藥進行同時檢測，從而實現樣品中農藥殘留的快速定性分析。如今已發展了較多的化學計量學方法如化學因子分析的一系列算法[17]以及連續小波變換算法[18]等。Wu等[19]采用非負免疫算法（non-negative immune algorithm，NNIA）對韭菜的GC-MS數據進行解析，可以實現韭菜中撲草凈的快速檢測。NNIA算法適合對樣品中的特定組分解析[20]，但較難實現復雜體系中多農藥殘留分析。本課題組[21]采用移動窗口目標轉化因子分析算法（moving window target transfer factor analysis method，MWTTFA），9 min內可得到36種農藥殘留信息。然而MWTTFA對更為復雜的多組分樣品進行解析時，往往出現誤判的情況，無法得到準確的定性結果。為此，本文提出了改進移動窗口目標轉化因子算法（improved movingwindowtargettransferfactoranalysis，IMWTTFA），并對混合農藥標準品進行自動化定性分析，并將標準洗脫和快速洗脫條件下的結果進行比較與分析，以期實現對多農藥組分的快速定性分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

QP 2010氣相色譜-質譜儀：日本島津儀器公司。

氟樂靈、克百威、阿特拉津、西瑪津、六氯苯、抗蚜威、撲草凈、甲基對硫磷、甲拌磷、甲基毒死蜱、三唑酮、二氯丙酸、喹硫磷、腐霉利、殺撲磷、苯線磷、4，4-滴滴滴、β-硫丹、三氯殺螨醇、敵菌丹、甲氰菊酯、三氯殺螨砜、伏殺磷、雙甲脒、氯菊酯、氯菊酯反式、氯氰菊酯、甲胺磷、乙酰甲胺磷、仲丁威、殘殺威、氧化樂、2-氯氰菊酯、丁酰肼、α-硫丹、乙硫磷、氰戊菊酯、異丙威、喹硫磷：天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 色譜、質譜條件

色譜質譜條件參照農業部標準NY 1380-2007《蔬菜、水果中51種農藥多殘留的測定氣相色譜-質譜法》[22]：GC-MS分析儀型號為QP2010 Ultra（日本島津），色譜柱CP-Sil8CB由美國VARIAN公司提供，規格為30 m×0.32 mm×0.25 μm；進樣口的溫度設置為250℃，進樣方式為不分流進樣。標準洗脫程序升溫操作：95℃保持1.5 min，以20℃/min升溫至190℃，5℃/min升溫至230℃，25℃/min升溫至290℃保持20 min。快速洗脫程序升溫操作：以60℃保持2 min，以80℃/min升溫至260℃，保持6 min；載氣為He（純度≥99.999%），進樣量為 2 μL，流速為 1.2 mL/min。電子轟擊源（EI）作為離子源，其溫度設置為230℃，傳輸線的溫度設置為280℃，電壓設置為70 eV。

1.3 試驗方法

本文在原有MWTTFA[21]的基礎上，根據檢測的實際條件對閾值進行調整并增加對匹配區域內保留時間譜峰的檢驗。IMWTTFA的計算有以下3個步驟：

1）收集常見240種農藥的質譜數據，所有的質譜圖均為標準化質譜圖，創建240種農藥的標準質譜庫。

2）以240種農藥標準質譜為輸入值，采用IMWTTFA對標準洗脫和快速洗脫條件下數據進行計算，由于在標準洗脫和快速洗脫試驗中得到的質譜與質譜庫中的標準質譜存在一定的差異，匹配度的閾值降低為60%，篩選出高于閾值的結果，若在較短的洗脫時間內存在明顯的高于閾值（60%）匹配區域，則初步判定該農藥組分存在。

3）根據第二步篩選的結果與色譜（總離子色譜流圖）的保留時間進行對比，如果色譜峰在此保留時間區域存在，則說明此農藥組分存在。

2 結果與討論

2.1 標準洗脫與快速洗脫條件色譜圖分析

按照農業部標準NY1380-2007《蔬菜、水果中51種農藥多殘留的測定氣相色譜-質譜法》[22]的色譜條件對多農藥殘留樣品進行檢測。此外，為實現對農藥殘留的快速檢測，采用縮減時間后的快速洗脫程序升溫對樣品進行檢測。農藥混合標準品的總離子色譜圖見圖1。

圖1色譜圖中（a）為標準洗脫條件的總離子流圖（35 min），（b）為快速洗脫條件總離子流圖（9 min）。數據點間隔均為0.47 s。圖1（a）中從5 min開始出峰，當9 min時譜峰比較集中；圖1（b）中從4 min開始出峰，譜峰集中在4 min～7 min。從總離子流圖中可知，存在較多的譜峰重疊與背景干擾，因此較難實現樣品中多農藥殘留的定性分析。

圖1 農藥混合標準品的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatography of standard pesticide mixtures

2.2 改進移動目標轉化因子解析結果分析

標準洗脫與快速洗脫程序解析結果對比見圖2～圖4。

以240種農藥標準質譜為輸入值，采用IMWTTFA對標準洗脫和快速洗脫條件下數據進行計算，經過第二步篩選后得到了標準洗脫條件下為63種可能農藥組分，快速洗脫條件下為47種可能農藥組分。以甲拌磷結果為例，圖2（a）為標準洗脫條件下甲拌磷匹配度圖；圖2（b）為快速洗脫條件下甲拌磷匹配度圖。

圖2 甲拌磷匹配曲線圖Fig.2 Matching curves of phorate

從圖2（a）可知當保留時間在9.076 min～9.262 min時，甲拌磷的匹配度超過60%且與總離子流圖中的保留時間進行匹配存在色譜峰，初步判斷甲拌磷農藥存在該樣品中。從圖2（b）可知當保留時間在4.428 min～4.561 min時，甲拌磷的匹配度超過60%且與總離子流圖中的保留時間進行匹配也存在色譜峰，初步判斷甲拌磷農藥存在該樣品中。

圖3為標準洗脫條件下敵樂胺匹配度曲線圖。

圖3 標準洗脫敵樂胺匹配度曲線圖Fig.3 The matching curve of standard elution dipyrolamine

由圖3可知，雖然整個洗脫時間內存在高于60%的匹配區域，但是并未在較短的洗脫時間內存在明顯高于閾值的匹配度區間。因此根據第二步篩選原則可判斷敵樂胺農藥不存在該樣品中。

圖4為快速洗脫條件下β-硫丹匹配度曲線圖。

圖4 快速洗脫β-硫丹匹配度曲線圖與多農藥殘留樣品的總離子流圖Fig.4 Matching curve of rapid elution of beta-endosulfan and total ion flow chromatogram of standard elution of multi-pesticides

從圖4可知，根據1.3中2）篩選原則保留時間在5.778 min～5.826 min時，此區域存在明顯高于閾值的匹配度；然而根據1.3中3）篩選原則將此區域與色譜圖總離子流的保留時間進行對比，發現色譜圖上并不存在譜峰，由此可判斷β-硫丹不存在該樣品中。

2.3 定性結果分析

本試驗將標準洗脫和快速洗脫條件下的結果進行比較與分析，以期實現對多農藥組分的快速定性分析。表1為多農藥殘留樣品在標準洗脫條件下各組分的中英文、CAS號、保留時間和匹配度。經IMWTTFA檢測到51種農藥組分。

由表 1 可知，β-硫丹、α-硫丹、雙甲脒-2、氯菊酯-2、氯菊酯反式-2、氯氰菊酯-2、仲丁威-2、殘殺威-2、氰戊菊酯-2、異丙威-2、2-氯氰菊酯-2此11種農藥僅存在于標準洗脫條件中。

表1 標準洗脫條件下各組分保留時間和匹配度數據表Table 1 Retention time and matching data of standard elution

續表1 標準洗脫條件下各組分保留時間和匹配度數據表Continue table 1 Retention time and matching data of standard elution

表2為多農藥殘留樣品在快速洗脫條件下各組分詳細的保留時間和匹配度。經IMWTTFA檢測到44種農藥組分。

表2 快速洗脫條件下各組分保留時間和匹配度數據表Table 2 Retention time and matching data of rapid elution

由表2可知，三氯殺螨醇-2、敵菌丹-2、丁酰肼-2此3種農藥僅存在于快速洗脫條件中。雙甲脒-2、氯菊酯-2、氯菊酯反式-2、氯氰菊酯-2、仲丁威-2、殘殺威-2、氰戊菊酯-2、異丙威-2、三氯殺螨醇-2、敵菌丹-2、丁酰肼-2、2-氯氰菊酯-2這12種農藥與雙甲脒-1、氯菊酯-1、氯菊酯反式-1、氯氰菊酯-1、仲丁威-1、殘殺威-1、氰戊菊酯-1、異丙威-1、三氯殺螨醇-1、敵菌丹-1、丁酰肼-1、2-氯氰菊酯的質譜相似，引起這種差異的結果可能是快速洗脫條件下的總離子流受樣品基質影響嚴重，導致農藥組分特別是同分異構體組分的譜峰被掩蓋。

2.4 改進移動目標轉化因子分析與移動目標窗口轉化因子分析方法結果的對比

按照已有文獻[23-24]將閾值調整為60%后，經IMWTTFA進行解析，標準洗脫條件第二步篩選農藥為65種農藥，快速洗脫條件第二步篩選農藥為47種農藥。標準洗脫條件下的敵樂胺、赤霉素、丁氟消等14種農藥都不存在色譜峰，根據第三步篩選的原則，這14種農藥都不存在該多農藥殘留樣品中，所以標準洗脫條件下經三步篩選為51種農藥；快速洗脫條件下的β-硫丹、赤霉素、丁酰肼-1此3種農藥都不存在色譜峰，根據第三步篩選的原則，這3種農藥都不存在該多農藥殘留樣品中，所以快速洗脫條件下經三步篩選為44種農藥。然而采用MWTTFA進行自動化檢測時，設置的閾值為75%，且只經過第一步和第二步的篩選，并沒有進行第三步譜峰檢驗，所以檢測出的多農藥殘留信息較少。所以本試驗利用IMWTTFA計算時，根據試驗條件對閾值進行調整，使組分能夠被正確檢測到；此外IMWTTFA還對計算結果進行了譜峰匹配，降低了試驗誤判的可能性。

3 結論

本文建立240種常見農藥的標準質譜數據庫，確定IMWTTFA對GC-MS數據進行自動化解析的篩選步驟。IMWTTFA可以實現多農藥殘留樣品中農藥組分的定性分析，且結果表明快速洗脫條件得到的檢測結果與標準洗脫條件得到的檢測結果基本一致，能夠為實際多農藥殘留檢測提供一種有效方法。然而，IMWTTFA雖然能夠較大程度得到樣品中可能存在的所有農藥的殘留信息，但遇到同分異構體組分質譜相近的情況時，較難得到所有組分信息，因此還需要對算法進一步改進。