超聲輔助提取藍靛果果實多糖的優化及清除自由基活性研究

楊露，鄭思韜，鮑元榕，武寶玉，王世杰，徐雅琴

（東北農業大學文理學院，黑龍江哈爾濱150030）

多糖（polysaccharide）是指由10個或10個以上單糖通過縮合而形成的鏈狀結構的物質，廣泛分布于植物、動物、微生物和海洋生物中，對生物的代謝、細胞生長等生命活動有著至關重要的作用[1]。研究表明，多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗血栓、降血糖等多種生物活性[2-3]。

藍靛果，學名藍靛果忍冬（Lonicera aerulea L.），又名黑瞎子果，是一種新興的小漿果，在我國，藍靛果主要分布在東北、華北和西北地區。研究表明藍靛果果實含有豐富的多酚（花色苷、黃酮）、多糖、維生素、礦物質和微量元素等多種活性物質，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、降血糖等功效[4-7]。目前，國內外針對藍靛果果實的研究主要集中在多酚類如黃酮類、花色苷等，對于藍靛果多糖的研究鮮有報道[8-9]。

超聲波輔助法是利用超聲波的空化作用、機械作用以及熱效應對原料中的有效成分進行提取，與傳統的溶劑提取法相比，能夠大大提高提取效率[10]。本文以藍靛果果實為原料，利用響應面法優化超聲波輔助藍靛果多糖提取工藝，并進一步測定其清除自由基（DPPH·、O2-·）能力。本試驗不僅拓展藍靛果果實的研究領域，而且為進一步研究藍靛果果實多糖提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍靛果果實：黑龍江省農科院牡丹江農科所；大孔吸附樹脂D4006：南開大學化工廠；所用試劑均為國產分析純。

JY92-IIV型超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；FDU-1100型冷凍干燥機：東京理化機械株式會社；WFJ-7200型可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藍靛果果實多糖的制備

稱取一定量藍靛果果實勻漿，按照一定的液料比加入去離子水，混勻后，置于一定時間、一定功率的超聲波條件下進行提取。提取液過濾、濃縮、醇沉（體積分數60%乙醇溶液），4℃冰箱靜置過夜，抽濾，凍干，即得粉紅色的藍靛果果實粗多糖。參考課題組前期工作[11]，選取大孔樹脂D4006對粗多糖進行初步純化，得到藍靛果多糖（blue honeysuckle polysaccharide，BHP）。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[12]。紫外檢測表明藍靛果多糖不含多酚和花色苷。

1.2.2 超聲波法輔助提取藍靛果果實多糖的單因素試驗

準確稱取藍靛果果漿10.0 g，放入500 mL燒杯中，在其他條件相同的情況下，采用不同液料比10∶1、20 ∶1、30 ∶1、40∶1、50 ∶1（mL/g），超聲波功率（200、300、400、500、600 W），提取時間（20、30、40、50、60 min）進行超聲波輔助提取試驗，以多糖得率為響應值，研究不同提取條件對提取效果的影響。藍靛果果實多糖得率計算公式：

式中：w為藍靛果果實質量，g；c為由標準曲線計算所得藍靛果果實多糖濃度，mg/mL；v為溶液體積，mL。

1.2.3 響應面優化超聲法輔助提取工藝研究

根據單因素試驗的結果，以提取時間（X1）、液料比（X2）和超聲功率（X3）為考察的變量，多糖的得率為響應值，通過Box-Behnken設計三因素三水平響應面分析試驗，優化超聲波輔助提取藍靛果多糖的工藝，采用Design-Expert軟件分析數據，建立三元二次模型進行擬合分析，模型擬合公式如下：

式中：Y是因變量；β0為常系數；βi為線性系數（主效應）；βii為二次系數；βij是兩因素交互作用系數。

1.2.4 藍靛果果實多糖清除自由基活性測定

參照文獻[13]，測定不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）藍靛果多糖對DPPH·和O2-·清除活性，VC為陽性對照。

1.3 數據處理

所有試驗數據均以3次試驗結果的平均數標準誤差（mean±SD）表示，采用DPS 6.5分析軟件對單因素試驗的各因素進行比較分析，采用Design-Expert 7.0軟件進行響應面試驗設計和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

單因素對多糖得率的影響見圖1。

圖1 單因素對多糖得率的影響Fig.1 Effects of singal-factor on polysaccharides yield

由圖1a可知，在10 min～40 min范圍內，隨著時間的增長，多糖得率先增加，隨后逐漸降低，40 min時達到最大值。多糖得率降低的原因可能是隨著時間的進一步延長，超聲波的空化作用使多糖發生降解使得率降低[14-15]。因此選取40 min作為提取的最佳時間，得率為（8.05±0.08）%。圖1b結果顯示，多糖得率隨著液料比的增大呈上升趨勢，當液料比為40∶1（mL/g）時，多糖得率最高為（8.26±0.09）%，隨后，開始降低。這可能是由于液料比增大，超聲波的空化作用會減弱，不利于多糖的提取；當溶劑適宜時，多糖溶出最多，得率最高[16]。因此選取40∶1（mL/g）作為提取的最佳液料比。超聲功率對多糖得率的影響見圖1c，隨著超聲功率的升高，得率先增加再減小，可能是超聲功率的增大，多糖會產生降解[17-18]。在300 W的條件下得率最高為（8.30±0.08）%，因此選取400 W作為提取的最佳超聲功率。

2.2 響應面優化分析

2.2.1 響應面分析結果

響應面試驗設計結果如表1所示。

表1 Box-Behnken設計方案及藍靛果果實多糖得率Table 1 Box-Behnken design and yield of the polysaccharides from blue honeysuckle fruits

用軟件Design-Expert 8.0.6統計軟件對響應面試驗設計結果進行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗，得到的回歸方程如下所示：

響應面試驗結果方差分析如表2所示。

表2 多糖得率方差分析Table 2 Variance analysis of the polysaccharides yield

由表2可知，回歸模型在統計學上差異極顯著（P<0.000 1），失擬項和變異系數的數值表明該試驗結果與數學模型具有較好擬合度，可用該模型對超聲波輔助提取藍靛果果實多糖進行預測。另外，由方差分析可知，各個因素間交互作用對多糖得率影響的顯著程度為X1X2>X2X3>X1X3。影響藍靛果多糖提取率大小因素依次為：提取時間>超聲功率>液料比。

2.2.2 模型準確性分析

模型準確性分析見圖2。

由圖2a可知，數據點基本集中在一條直線上，殘差符合正態分布規律；由圖2b可知，各個殘差的分布分散且無規則，都在合理的極限范圍內，說明殘差數據正常。真實值和擬合值的關系如圖2c所示，二者的數據點均集中在一條直線附近，試驗結果與模型擬合值比較接近。綜上可知，本試驗建立的模型合理，適合優化超聲提取藍靛果果實多糖。

2.2.3 邊際效應分析

單因子邊際效應曲線見圖3。

圖2 模型準確性分析Fig.2 Accuracy analysis of model

圖3 單因子邊際效應曲線Fig.3 Marginal effect curve of single factor

如圖3所示，當提取時間、液料比和超聲功率低于各自的臨界編碼值（0.10、0.05、0.12）時，多糖得率增加速率大于零，但呈下降的趨勢，說明多糖得率隨著各因素的增大而逐漸達到最大值；當三者分別取臨界編碼值時，多糖得率增長率均為零，即多糖得率達到最大；當高于臨界編碼值時，多糖得率增長率小于零，說明多糖得率開始下降并且下降的速率逐漸增大。由圖3可知，各因素的變化程度的大小順序為：提取時間>超聲功率>液料比，與方差分析的結果一致。

2.2.4 交互效應分析

為了得到某兩個因素同時對多糖得率Y值的影響，觀察在其它因素條件固定不變情況下，某兩個因素對多糖得率Y值的影響。用Design-Expert 8.0.6軟件作出相應的響應面圖，對這些因素中交互項之間的交互效應進行分析，如圖4所示。

圖4 各因素間的交互作用Fig.4 Interaction among factors

由圖4a可知，時間與液料比對多糖得率的交互影響呈拋物線形，說明時間與液料比的交互作用對多糖得率影響顯著。由圖變化趨勢可知，當時間在35 min～45 min 之間某固定值，液料比在 32 ∶1（mL/g）～47∶1（mL/g）之間某固定值時，曲面有最高點，即在此區間某一固定條件，多糖得率有最值；圖4b拋物線曲面顯示超聲功率和提取時間的交互作用對多糖得率的影響明顯。當提取時間在35 min～47 min，功率在220 W～400 W范圍內，多糖的得率比較高。由圖4c可知，在液料比取 35 ∶1（mL/g）～45 ∶1（mL/g）、超聲功率取270 W～380 W的范圍內，多糖得率相對較大，且在此范圍內，多糖得率可取最大值。當液料比一定時，隨著超聲功率的增大，多糖得率增大，超聲功率繼續增大，得率有下降的趨勢；當超聲功率一定時，隨著液料比的增大，多糖得率先增大后減小。

經以上回歸模型分析，藍靛果果實多糖的最佳提取工藝為：提取時間 41.10 min，液料比 40.70∶1（mL/g），超聲功率309.15W。結合生產實際，將各因素調整為提取時間 41 min，液料比 41 ∶1（mL/g），超聲功率 310 W進行3次平行試驗。在此條件下，多糖得率實際測量值（8.31±0.23）%與預測值8.36%接近，表明用響應面法優化超聲波輔助提取藍靛果果實多糖的工藝條件是可行的。

2.3 藍靛果實多糖清除自由基活性

研究表明許多疾病的發生和發展同自由基密切相關，據報道，由過量自由基引起的疾病，已超過100余種，如高血壓、糖尿病、癌癥，類風濕關節炎、動脈粥樣硬化以及老年癡呆等[19-21]。因此尋找高效、廉價、低毒天然抗氧劑，清除體內自由基，對治療疾病和保護人體健康很有益處。

多糖BHP對DPPH·和O2-·兩種自由基的清除效果見圖5。

圖5 藍靛果多糖清除自由基能力Fig.5 Scavenging activities of the polysaccharide on the radicals

由圖5可知，當濃度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL時，多糖BHP對DPPH·的抑制能力隨著濃度的增高而增大（P<0.05），在1.0 mg/mL時，抑制率達到最大（53.78±0.89）%，IC50為 5.40 mg/mL。當濃度在 0.1 mg/mL～0.4 mg/mL時，多糖BHP對O2-·的清除能力隨著濃度的增高而增大（P<0.05）；在 0.4 mg/mL～1.0 mg/mL 時，BHP的清除能力隨著濃度的增高變化較小，在1.0 mg/mL時，清除率達到最大（67.79±1.01）%，IC50為 0.28mg/mL。可知，藍靛果多糖對2種自由基均有一定的清除作用，但清除能力均小于對照VC。

3 結論

響應面分析得到回歸模型合理，試驗結果與模型擬合值接近，適合優化超聲輔助提取藍靛果果實多糖。超聲波輔助提取藍靛果果實多糖最佳提取工藝條件為：提取時間 41 min，液料比 41 ∶1（mL/g），超聲功率310 W，得率為（8.31±0.23）%。影響藍靛果多糖提取率大小因素依次為：提取時間>超聲功率>液料比。藍靛果多糖BHP對DPPH·和O2-·均具一定的清除活性，IC50分別為 5.40、0.28 mg/mL。