響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助溶劑提取香蕉5-羥色胺的工藝

童漢清，海金萍，*，李樹長，張強(qiáng)

（1.廣東省嶺南特色果蔬加工及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東普通高校食品科學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，廣東茂名525000；2.廣東石油化工學(xué)院，廣東茂名525000）

5-羥色胺是一種吲哚衍生物，分子式C10H12N2O，其英文名為5-hydroxytryptamine，簡稱5-HT，最早是從血清中發(fā)現(xiàn)的，又名血清素，其在大腦皮質(zhì)及神經(jīng)突觸內(nèi)水平很高，是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1-2]，它能調(diào)節(jié)情緒、精力，增強(qiáng)記憶力，產(chǎn)生愉悅的情緒，在緩解阿爾茨海默病癥狀中發(fā)揮積極作用[3-4]。最近的研究表明，5-羥色胺是腸道每個(gè)主要相關(guān)功能的重要介質(zhì)，可以影響腸內(nèi)炎癥的發(fā)展和嚴(yán)重程度[5]；5-羥色胺衍生物可以調(diào)節(jié)人體免疫力，具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除DPPH自由基活性以及抑制腫瘤作用[6-7]，而5-羥色胺系統(tǒng)功能紊亂可能是導(dǎo)致抑郁癥的直接原因之一[8]。

5-羥色胺在自然界和哺乳動(dòng)物組織中都普遍存在，研究人員發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物的血液和腸道組織、蝎子等昆蟲的毒液、魚的唾液腺等組織中存在5-羥色胺，沙棘、桃子、香蕉、紅花籽、加納籽、番茄、菠蘿等植物中也存在有不同含量的5-羥色胺[9-14]。陳晨等[15]對核桃中5-羥色胺的提取及活性進(jìn)行了研究。

香蕉為芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬植物，含有豐富的5-羥色胺，這種化學(xué)成分能給人帶來歡樂、平靜及瞌睡的信號，因此，香蕉又被稱為“快樂食品”[16-18]，具有極高的有效成分提取及綜合利用價(jià)值[19]。易曉敏等、唐雪娟等、白永亮等分別對香蕉低聚糖的提取進(jìn)行了研究[20-22]，常秀蓮等[23]研究了香蕉多酚的提取工藝，而關(guān)于從香蕉中提取5-羥色胺的研究尚未見報(bào)道。香蕉是茂名的特色水果之一，四季皆有種植且量很大，該文對香蕉中5-羥色胺進(jìn)行提取研究，以期為香蕉的綜合加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉（七成熟）：廣東省茂名市茂南區(qū)河西農(nóng)貿(mào)市場。

甲醇、氯化鈉、無水碳酸鈉、亞硫酸氫鈉：天津市百世化工有限公司；檸檬酸、冰乙酸：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無水乙醇：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；對-二甲氨基苯甲醛：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，以上試劑均為分析純。5-羥色胺（對照品）：南京森貝伽生物科技有限公司。

超聲波清洗機(jī)（XO-120D）：南京先歐儀器制造有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（KW-1000DC）：江蘇金壇市億通電子有限公司；電動(dòng)離心機(jī)（80-2型）：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；高速多功能粉碎機(jī)（LPE-800A）：歐凱萊芙（香港）有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1800）：上海美譜達(dá)儀器有限公司；精密電子天平（JA1003）：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 香蕉預(yù)處理及5-羥色胺的提取流程

香蕉→清洗→去皮切片→0.4%硫酸氫鈉、0.3%檸檬酸、0.4%氯化鈉混合溶液護(hù)色→晾干→熱風(fēng)干燥、粉碎過篩→香蕉粉→以乙醇溶劑配合超聲波輔助提取5-羥色胺→離心管離心→上清液即為5-羥色胺粗提液→轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶以乙醇溶液定容→采用埃爾利希試劑分光光度法測定提取收率。

1.2.2 5-羥色胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用埃爾利希試劑分光光度法[24]。

準(zhǔn)確稱取0.005 0 g的5-羥色胺對照品，用甲醇配制成2.84 mmol/L的5-羥色胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mL 5-羥色胺標(biāo)準(zhǔn)溶液于11個(gè)10 mL容量瓶，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋至4 mL，再各加入顯色劑埃爾利希試劑5 mL，于50℃水浴顯色30 min，取出冷卻至室溫（26℃～29℃），用0.1 mol/L HCl溶液定容。以試劑空白為對照，在500 nm～640 nm波長范圍內(nèi)掃描獲得最大吸收波長584 nm處測定吸光度，以5-羥色胺對照品的濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.557 8x+0.023，R2=0.999 3。

1.2.3 5-羥色胺提取收率的測定

準(zhǔn)確稱取香蕉粉0.50g，在一定條件下提取5-羥色胺，離心所得提取上清液置于10 mL容量瓶中，用與提取所用相同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液定容，得5-羥色胺提取液。移取提取液1.0mL于10mL容量瓶中，加3 mL 0.1mol/L HCl、5 mL顯色劑后搖勻，于50℃水浴30min，取出冷卻至室溫（26℃～29℃），再用0.1 mol/L HCl定容，測定吸光度，通過所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求出提取液中5-羥色胺的濃度，再由公式（1）計(jì)算出5-羥色胺的提取收率。

式中：c為方程所求樣品溶液中5-羥色胺的濃度，g/L；V為樣品溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為香蕉粉樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 5-羥色胺提取工藝的單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對5-羥色胺提取收率的影響

準(zhǔn)確稱取0.50 g香蕉粉，固定超聲時(shí)間30 min、超聲溫度40℃、料液比1∶20（g/mL），選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%和90%的萃取溶劑，分別進(jìn)行香蕉粉中5-羥色胺的溶劑提取試驗(yàn)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對5-羥色胺提取收率的影響。

1.2.4.2 超聲時(shí)間對5-羥色胺提取收率的影響

準(zhǔn)確稱取0.50 g香蕉粉，固定超聲溫度40℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20（g/mL），選取超聲時(shí)間為 20、30、40、50、60 min，分別進(jìn)行香蕉粉 5-羥色胺的超聲輔助溶劑提取試驗(yàn)，考察超聲時(shí)間對5-羥色胺提取收率的影響。

1.2.4.3 超聲溫度對香蕉5-羥色胺提取收率的影響

準(zhǔn)確稱取0.50 g香蕉粉，固定超聲時(shí)間40 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶20（g/mL），選取超聲溫度為 10、20、30、40、50 ℃，分別進(jìn)行香蕉粉中 5-羥色胺的超聲輔助溶劑提取試驗(yàn)，考察超聲溫度對5-羥色胺提取收率的影響。

1.2.4.4 料液比對香蕉5-羥色胺提取收率的影響

準(zhǔn)確稱取0.50 g香蕉粉，固定超聲時(shí)間40 min、超聲溫度30℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，選取香蕉粉與萃取劑料液比為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），分別進(jìn)行香蕉粉中5-羥色胺的超聲輔助溶劑提取試驗(yàn)，考察料液比對香蕉5-羥色胺提取收率的影響。

1.2.5 5-羥色胺提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)分析結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法[25-27]，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度這3個(gè)對5-羥色胺提取收率影響較大的因素，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以提取收率為響應(yīng)值（Y）進(jìn)行優(yōu)化，所有試驗(yàn)均3次重復(fù)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.3 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，采用Design-Expert 8.06軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助溶劑提取香蕉果肉5-羥色胺的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對5-羥色胺提取收率的影響

5-羥色胺是一種帶有極性基團(tuán)（-NH2和-OH）的吲哚衍生物，可采用具有一定極性的乙醇溶液進(jìn)行提取，乙醇溶劑濃度對5-羥色胺提取收率的影響見圖1。

圖1 乙醇溶劑濃度對5-羥色胺提取收率的影響Fig.1 Effect of ethanol solvent concentration on extraction yield of 5-HT

由圖1可知，香蕉5-羥色胺的提取收率隨提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，乙醇溶劑濃度為70%時(shí)，提取收率達(dá)到最大值。

2.1.2 超聲時(shí)間對5-羥色胺提取收率的影響

超聲波是一種機(jī)械波，有效頻率一般在20 kHz～50 kHz。超聲波輔助提取是利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、高加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，破壞細(xì)胞壁，增加溶劑穿透力，從而達(dá)到加速提取細(xì)胞內(nèi)容物的過程。超聲時(shí)間對5-羥色胺提取收率的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對5-羥色胺提取收率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction yield of 5-HT

圖2表明，超聲時(shí)間對香蕉5-羥色胺的提取收率有顯著影響。超聲作用40 min時(shí)，5-羥色胺的提取收率最大，超過40 min，蛋白質(zhì)、多糖類成分等物質(zhì)會(huì)溶出，影響5-羥色胺的提取，同時(shí)超聲時(shí)間過長還會(huì)破壞5-羥色胺的結(jié)構(gòu)，使提取收率下降。

2.1.3 超聲溫度對香蕉5-羥色胺提取收率的影響

超聲溫度對5-羥色胺提取收率的影響見圖3。

由圖3可知，升溫初期，5-羥色胺的提取收率隨著超聲溫度升高而增大，30℃時(shí)達(dá)最大值，之后開始下降。這是因?yàn)椋郎爻跗谳腿∫吼ざ入S溫度升高而降低、湍動(dòng)程度增大，從而增加傳質(zhì)系數(shù)，有利于溶質(zhì)的擴(kuò)散傳質(zhì)，因而萃取效果增強(qiáng)。但溫度過高，5-羥色胺分子結(jié)構(gòu)上的酚羥基會(huì)發(fā)生氧化，結(jié)構(gòu)被破壞。

圖3 超聲溫度對5-羥色胺提取收率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of 5-HT

2.1.4 料液比對香蕉5-羥色胺提取收率的影響

料液比對5-羥色胺提取收率的影響見圖4。

圖4 料液比對5-羥色胺提取收率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of 5-HT

圖4表明，5-羥色胺的提取收率隨著溶劑量的增大而增加，料液比1∶20（g/mL）時(shí)，再增加提取劑的量，5-羥色胺提取收率也增加不大。由于溶劑過多會(huì)造成資源浪費(fèi)且不利于后續(xù)的濃縮，綜合考慮，確定1∶20（g/mL）為最佳提取料液比。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化香蕉粉5-羥色胺提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experiment results

續(xù)表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken design and experiment results

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到香蕉粉5-羥色胺提取收率（Y）對乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲溫度（C）的二元多項(xiàng)回歸方程：Y=33.56+2.96A-0.58B+2.20C+0.81AB+1.17AC-0.71BC-5.67A2-0.38B2-7.19C2。

利用Design Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析如表3。

表3 回歸方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression equation

回歸模型（p<0.000 1）極顯著，失擬項(xiàng)（p=0.287 0>0.05）差異不顯著；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.998 1，表明該模型與試驗(yàn)擬合良好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.995 7，說明99.57%的響應(yīng)值變化可以通過模型進(jìn)行解釋。所以可以使用該模型進(jìn)行預(yù)測香蕉粉5-羥色胺的提取收率。回歸模型中一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2、C2差異極顯著，只有二次項(xiàng)中B2差異不顯著；交互項(xiàng)中AB、AC、BC差異均極顯著，即乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度、超聲時(shí)間和超聲溫度均存在交互作用，這表明各因素對香蕉粉5-羥色胺提取收率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.3 因素間交互作用分析

因素間交互作用的響應(yīng)面圖與等高線圖如圖5～圖7所示。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時(shí)間的交互作用對5-羥色胺提取收率的影響Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of ethanol volume fraction and ultrasonic time on extraction yield of 5-HT

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度的交互作用對5-羥色胺提取收率的影響Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of ethanol volume fraction and ultrasonic temperature on extraction yield of 5-HT

圖7 超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用對5-羥色胺提取收率的影響Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of ultrasonic time and ultrasonic temperature on extraction yield of 5-HT

乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲溫度及其交互作用對響應(yīng)值的影響可以從圖中直觀地反映出來，等高線的形狀可以反映其交互作用的大小，當(dāng)?shù)雀呔€的形狀為橢圓形時(shí)，說明其交互作用顯著；當(dāng)?shù)雀呔€的形狀為圓形時(shí)，說明其交互作用不顯著[28]。由圖5～圖7可知，在交互作用對5-羥色胺提取得率的影響中，超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度與超聲時(shí)間的交互作用較為顯著。

2.2.4 最優(yōu)工藝條件的預(yù)測及驗(yàn)證

通過該回歸方程求得優(yōu)化后的香蕉果肉5-羥色胺的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72.30%，超聲時(shí)間32.76 min、超聲溫度32.08℃，該條件下5-羥色胺提取收率為34.342 5 mg/g。考慮實(shí)際操作的簡便性，將優(yōu)化后工藝條件修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72%，超聲時(shí)間33 min、超聲溫度32℃，并在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該條件下香蕉5-羥色胺提取收率的平均值為32.986 7 mg/g，與理論預(yù)測值34.342 5 mg/g的相對誤差為3.95%，小于5%，因此應(yīng)用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

以香蕉為試驗(yàn)原料，采用超聲輔助乙醇溶劑提取其果肉粉中的5-羥色胺，通過單因素試驗(yàn)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和超聲溫度作為影響5-羥色胺提取收率最大的3個(gè)因素。考慮到因素間的交互影響，利用Box-Behnken原理設(shè)計(jì)三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)，建立了香蕉粉5-羥色胺提取收率的數(shù)學(xué)模型，在料液比為1∶20（g/mL）的條件下，確定提取香蕉粉5-羥色胺最佳的工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72%，超聲時(shí)間33 min、超聲溫度32℃；在此工藝條件下，香蕉粉5-羥色胺提取收率為32.986 7 mg/g，與預(yù)測值的相對誤差為3.95%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件真實(shí)可靠。