蛹、米蟲(chóng)草多糖含量及抗氧化活性比較研究

白麗丹，段懿涵，譚超杰，李春陽(yáng)，王博，盛瑜

（北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林132013）

北蟲(chóng)草（Cordyceps militaris），于1958年在吉林省首次發(fā)現(xiàn)，又名北冬蟲(chóng)夏草，蛹蟲(chóng)草，與冬蟲(chóng)夏草同屬不同種[1]。它是由子座（即草部分，又稱(chēng)子實(shí)體）與菌核（即蟲(chóng)的尸體部分）組成的復(fù)合體[2]。研究發(fā)現(xiàn)，北蟲(chóng)草的有效化學(xué)成分主要包括蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸等，同時(shí)還含有各種蛋白質(zhì)和人體所必需的氨基酸，鈣、鋅、硒、錳等微量元素[3]。其中，蟲(chóng)草多糖是北蟲(chóng)草最豐富的成分之一，具有廣泛的生物活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等功效，尤其在清除自由基的方面功能顯著[4]。研究表明，人體在新陳代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生超氧自由基、羥自由基、過(guò)氧化氫等活性氧，但一般處于低水平的平衡狀態(tài)，隨著人們年齡的增長(zhǎng)，人體清除這些自由基能力會(huì)逐漸下降，殘留的自由基導(dǎo)致細(xì)胞和細(xì)胞膜過(guò)氧化損傷，從而加速各器官的衰老，并增加各種疾病發(fā)生的機(jī)率[5-7]。因此，具有清除自由基功效的蟲(chóng)草多糖可作為天然的抗氧化劑，具備成為抗氧化保健食品和化妝品原料的潛質(zhì)。

目前，市場(chǎng)上常見(jiàn)的北蟲(chóng)草子實(shí)體有兩種，一種是以蠶蛹為培養(yǎng)基的蛹蟲(chóng)草，一種是以大米為培養(yǎng)基的米蟲(chóng)草，二者因培養(yǎng)成本的差異導(dǎo)致其在市場(chǎng)上的價(jià)格有明顯區(qū)別，但在生產(chǎn)和生活中常被混淆使用，對(duì)于其功效是否一致未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以北蟲(chóng)草子實(shí)體多糖的提取為基礎(chǔ)，以其體外抗氧化活性為指標(biāo)，考察不同培養(yǎng)基（蠶蛹和大米）的北蟲(chóng)草抗氧化能力的差異，為研究北蟲(chóng)草多糖的藥理作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步確立開(kāi)發(fā)北蟲(chóng)草多糖成為抗氧化保健食品的原料來(lái)源，為吉林省北蟲(chóng)草生產(chǎn)基地提供相關(guān)信息，促進(jìn)其增加北蟲(chóng)草的產(chǎn)品附加值，增強(qiáng)其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米蟲(chóng)草、蛹蟲(chóng)草：沈陽(yáng)聚鑫北蟲(chóng)草菌業(yè)有限公司；澄清劑：北京正天澄清技術(shù)有限公司；DPPH：上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司；三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）：南京都萊生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、冰乙酸、硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

酶標(biāo)儀（Infinite M200）：瑞士 Tecan公司；恒溫混勻儀（ThermoMixer C）：德國(guó)Eppendorf公司；恒溫水浴鍋（HH-S1-Ni）：北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；真空干燥箱（DZ-1BCⅡ）：北京中西遠(yuǎn)大有限公司；電子天平（AL204）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蟲(chóng)草多糖的提取與純化

取蛹蟲(chóng)草和米蟲(chóng)草干燥子實(shí)體粉末（40目），乙酸乙酯、無(wú)水乙醇去除脂溶性、醇溶性雜質(zhì)，濾渣自然揮干，熱水浸提，Sevag法去蛋白，離心，取上清液，均分5等份，分別加入無(wú)水乙醇使溶液中乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%、60%、70%、80%、90%，靜置 12 h，收集沉淀烘干，即得粗多糖。將上述粗多糖復(fù)溶，透析，除去小分子雜質(zhì)，冷凍干燥得精制多糖。

1.2.2 多糖含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：稱(chēng)取葡萄糖標(biāo)品10 mg，定容至100 mL容量瓶中，得濃度為0.1 mg/mL對(duì)照品溶液。依次吸取對(duì)照品溶液 0、0.05、0.1、0.2、0.4 mL，加 6%苯酚溶液0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，充分振搖，室溫（20℃）放置10 min。于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

樣品含量測(cè)定：精密稱(chēng)定精制多糖0.1 g，定容至50 mL容量瓶中，使終濃度為2 mg/mL，充分搖勻，即得。測(cè)定方法同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算多糖含量。

式中：X為樣品中多糖含量，%；C為多糖濃度，g/mL；D為樣品稀釋倍數(shù)；V為樣品體積，mL；G為菌絲體干重，g。

1.2.3 多糖抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

將各級(jí)醇沉多糖依次配制成濃度為2、1.6、1.2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/mL 的待測(cè)樣品溶液 100 μL，加入10 mmol/mL DPPH溶液100 μL，25℃恒溫箱靜置30 min，于517 nm處測(cè)量其吸光度（Ai）；每組3次平行試驗(yàn)，以VC水溶液作陽(yáng)性對(duì)照[8-9]。清除率公式計(jì)算如下：

式中：A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；Aj為無(wú)水乙醇替換DPPH溶液的吸光度。

1.2.3.2 羥基自由基（·OH）清除率測(cè)定

取濃度為 5、4、3、2、1、0.5 mg/mL 的樣品溶液各50 μL，加入 6 mmol/L FeSO4水溶液、6 mmol/L 水楊酸溶液、6 mmol/L H2O2溶液各50 μL，混合均勻，37℃恒溫箱靜置30 min在520 nm處測(cè)量其吸光度（Ai）。以VC水溶液作陽(yáng)性對(duì)照[9-10]。按如下公式計(jì)算清除率：

式中：A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；Aj為蒸餾水替換雙氧水溶液的吸光度。

1.2.3.3 鐵離子還原能力法（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測(cè)定北蟲(chóng)草多糖抗氧化能力

FRAP工作液300 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液、20 mmol/LFeCl3，體積比 10 ∶1 ∶1混合，現(xiàn)用現(xiàn)配，以FeSO4溶液為標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品液稀釋至適宜濃度，精密吸取20 μL樣品溶液和150 μL工作液，于593 nm處測(cè)量其吸光度，F(xiàn)RAP以 FeSO4mmol/g 表示[11-13]。

1.2.4 北蟲(chóng)草多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

1.2.4.1 北蟲(chóng)草多糖對(duì)正常PC12細(xì)胞的毒性試驗(yàn)

從兩組多糖中各選出抗氧化活性較好的醇沉組分，即70%米蟲(chóng)草多糖（Cordyceps oryzae polysaccharide，COP），80%蛹蟲(chóng)草多糖（Cordycepsmilitarispolysaccharides，CMP）作為研究對(duì)象。試驗(yàn)分組：正常對(duì)照組（CON）、米蟲(chóng)草多糖（70%）試驗(yàn)組（0.1、1、10、100 μg/mL）、蛹蟲(chóng)草多糖（80%）試驗(yàn)組（0.1、1、10、100 μg/mL）。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞（5×104個(gè)/mL），接種于 96 孔板，每孔 100 μL，每組各 3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，試驗(yàn)組加入100 μL不同濃度的北蟲(chóng)草多糖，對(duì)照組加入100 μL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔各加20 μL噻唑蘭 [3-（4，5-dimethy l-2-thiazoly l）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]（5 mg/mL），4 h后將上清液吸出，加入150 μL二甲基亞砜，搖勻，放置5 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值[14-16]。損傷組吸光度值與正常對(duì)照組的比值即為細(xì)胞活力值。

1.2.4.2 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為 5×104個(gè)/mL。設(shè)置正常對(duì)照組（CON）和H2O2濃度損傷組（100、200、300、400、500 μmol/L），將細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL，每組各3個(gè)復(fù)孔。于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，損傷組分別加入不同濃度的 H2O2溶液 100 μL，對(duì)照組加入 100 μL 培養(yǎng)液，各個(gè)濃度分別損傷 1、2、3、4、5 h。損傷結(jié)束后，MTT 法測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力值[17-19]。

1.2.4.3 北蟲(chóng)草多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞（5×104個(gè)/mL），將其接種于96孔板，設(shè)置正常對(duì)照組（CON）、模型組（MOD）、米蟲(chóng)草多糖（70%）試驗(yàn)組（0.1、1、10、100 μg/mL）、蛹蟲(chóng)草多糖（80%）試驗(yàn)組（0.1、1、10、100 μg/mL）。每孔中加入細(xì)胞懸液 100 μL，在 37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，模型組與試驗(yàn)組每孔加入100 μL濃度為300 μmol/L的H2O2溶液培養(yǎng)3 h后將模型組和試驗(yàn)組每孔吸出100 μL上清液，試驗(yàn)組加入不同濃度的北蟲(chóng)草多糖溶液100 μL，對(duì)照組與模型組各加入100 μL培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔各加20 μL MTT（5 mg/mL），4 h 后將上清液吸出，加入 150 μL 二甲基亞砜，搖勻，放置5 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力值[18，20-22]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次。采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多糖含量、FRAP值均以（±S）表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析由Graphpad Prism7.00統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測(cè)定

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

以葡萄糖為對(duì)照品溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程Y=0.014 9x-0.009 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.1.2 含量測(cè)定

兩種蟲(chóng)草多糖提取率及純度比較見(jiàn)表1。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of glucose solution

表1 兩種蟲(chóng)草多糖提取率及純度比較Table 1 Comparison of extraction rate and purity of CMP and COP

由表1結(jié)果可知，隨著沉淀體系中乙醇濃度的升高，米蟲(chóng)草多糖與蛹蟲(chóng)草多糖的提取率逐步增多，但各級(jí)醇沉組分多糖含量分布不均。多糖提取率以?xún)龈珊蟮亩嗵琴|(zhì)量占蟲(chóng)草子實(shí)體粉末的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示[23]。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除率

由不同濃度乙醇沉淀的蟲(chóng)草多糖對(duì)DPPH自由基清除率見(jiàn)圖2。

由圖2結(jié)果分析可知，米蟲(chóng)草多糖和蛹蟲(chóng)草多糖都具有清除DPPH自由基的作用，且清除能力呈量效正相關(guān)。乙醇濃度為50%時(shí)，兩種多糖對(duì)DPPH自由基的清除率無(wú)顯著差異，乙醇濃度為70%時(shí)，米蟲(chóng)草多糖作用效果略高于蛹蟲(chóng)草多糖，其余各級(jí)醇沉組分中蛹蟲(chóng)草多糖清除能力較強(qiáng)，與米蟲(chóng)草多糖相比差異較顯著。

兩種蟲(chóng)草各級(jí)醇沉組分組間清除DPPH自由基能力大小順序如圖1G、圖1H所示，米蟲(chóng)草多糖各級(jí)醇沉組分清除能力依次為70%、90%、80%、60%、50%。蛹蟲(chóng)草多糖各級(jí)醇沉組分清除能力依次為80%、70%、90%、60%、50%。

圖2 不同濃度乙醇沉淀的兩種蟲(chóng)草多糖DPPH自由基清除率比較Fig.2 Comparison of DPPH radical scavenging rate of COP and CMP precipitated by different concentrations of ethanol

2.2.2 ·OH清除率

由不同濃度乙醇沉淀的蟲(chóng)草多糖對(duì)·OH清除率見(jiàn)圖3。

由圖3結(jié)果分析可知，兩種多糖各組分對(duì)羥基自由基均有一定的清除作用。乙醇濃度為70%時(shí)，米蟲(chóng)草多糖清除率略高于蛹蟲(chóng)草多糖，其余各級(jí)醇沉組分相比蛹蟲(chóng)草多糖作用效果好。米蟲(chóng)草各級(jí)醇沉組分組間清除羥基自由基能力依次為80%、70%、90%、60%、50%，蛹蟲(chóng)草多糖各級(jí)醇沉組分清除能力大小與DPPH自由基清除能力一致。

2.2.3 北蟲(chóng)草多糖的FRAP值

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖4。

圖3 不同濃度乙醇沉淀的蟲(chóng)草多糖對(duì)羥基自由基清除率比較Fig.3 Comparison of hydroxyl radical scavenging rate of COP and CMP precipitated by different concentrations of ethanol

圖4 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 FeSO4standard curve

根據(jù)593 nm測(cè)得FeSO4溶液的吸光值，繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程Y=0.743x+0.038 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7。

不同乙醇濃度沉淀的蟲(chóng)草多糖FRAP，見(jiàn)圖5。

圖5 不同乙醇濃度沉淀的蟲(chóng)草多糖FRAPFig.5 FRAP of COP and CMP precipitated with different ethanol concentrations

由圖5結(jié)果分析可知，蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)Fe3+的還原能力高于米蟲(chóng)草多糖。在兩種蟲(chóng)草的不同醇沉組分中，90% CMP、70% COP 對(duì) Fe3+的還原能力較強(qiáng)，F(xiàn)RAP分別為 0.744 4、0.564 7 mmol/g。

2.3 兩種蟲(chóng)草多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用

2.3.1 北蟲(chóng)草多糖對(duì)正常PC12細(xì)胞的毒性試驗(yàn)

北蟲(chóng)草多糖對(duì)正常PC12細(xì)胞的增殖影響見(jiàn)圖6。

由圖6結(jié)果可知，兩種不同來(lái)源北蟲(chóng)草中的多糖對(duì)PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)均無(wú)細(xì)胞毒性，濃度達(dá)到10、100 μg/mL時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞顯著增殖。

2.3.2 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建

H2O2濃度及損傷時(shí)間的篩選見(jiàn)圖7。

由圖7結(jié)果分析可知，隨著H2O2濃度和損傷時(shí)間增加，PC12細(xì)胞的損傷情況也隨之加重，當(dāng)H2O2濃度為300 μmol/L、損傷時(shí)間3 h時(shí)，細(xì)胞活力為57.91%，損傷程度適宜，因此將其作為構(gòu)建PC12細(xì)胞損傷模型的條件。

圖6 兩種蟲(chóng)草多糖對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of COP and CMP on the proliferation of PC12 cells

圖7 H2O2濃度及損傷時(shí)間的篩選Fig.7 Screening of H2O2concentration and injury time

2.3.3 北蟲(chóng)草多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

北蟲(chóng)草多糖對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞活力的影響見(jiàn)圖8。

圖8 兩種北蟲(chóng)草多糖對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effect of COP and CMP on the viability of PC12 cells injured by H2O2

由圖8分析可知，經(jīng)H2O2處理后，PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制（P<0.01），與正常細(xì)胞相比，其存活率下降為57.63%。經(jīng)北蟲(chóng)草多糖處理后，細(xì)胞的增殖活性呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，當(dāng)劑量達(dá)到100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率的升高具有顯著性差異（P<0.01），蛹蟲(chóng)草多糖細(xì)胞存活率達(dá)到90.45%，米蟲(chóng)草多糖細(xì)胞存活率達(dá)到82.62%。

3 結(jié)論

在對(duì)兩種不同來(lái)源蟲(chóng)草的多糖研究中發(fā)現(xiàn)，米蟲(chóng)草多糖在提取率及含量方面高于蛹蟲(chóng)草多糖，兩種多糖的提取率隨著乙醇濃度增加而增加，但多糖含量分布不均。兩種北蟲(chóng)草的各級(jí)醇沉多糖中，80% CMP和70% COP清除自由基能力較強(qiáng)；FRAP法結(jié)果表明蛹蟲(chóng)草各級(jí)醇沉組分作用效果優(yōu)于米蟲(chóng)草。結(jié)合兩種蟲(chóng)草組間各級(jí)醇沉多糖抗氧化能力分析，當(dāng)乙醇濃度為70%～90%時(shí)所得多糖體外抗氧化效果較好，但從資源成本方面考慮，不宜用90%的濃度進(jìn)行醇沉。總體來(lái)看，兩種蟲(chóng)草多糖均具有一定的體外抗氧化能力，蛹蟲(chóng)草多糖作用效果優(yōu)于米蟲(chóng)草多糖。

根據(jù)體外抗氧化能力試驗(yàn)結(jié)果，選取沉淀體系為乙醇濃度80%的蛹蟲(chóng)草多糖和70%的米蟲(chóng)草多糖為研究對(duì)象。當(dāng)多糖濃度為10 μg/mL和100 μg/mL、作用時(shí)間24 h時(shí)，可顯著促進(jìn)正常PC12細(xì)胞的增殖。由H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的PC12細(xì)胞經(jīng)兩種不同來(lái)源的蟲(chóng)草多糖處理后，細(xì)胞存活率都有不同程度的提升，呈濃度依賴(lài)性；當(dāng)多糖濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率顯著增加，且蛹蟲(chóng)草多糖作用效果優(yōu)于米蟲(chóng)草多糖，與體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果一致。試驗(yàn)通過(guò)確定二者在有效成分含量和功效方面的差異，可為提高北蟲(chóng)草質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。