不同因素對早熟陸地棉離體胚成苗的影響

李春平，賴成霞，徐海江，張建國，瑪依拉·玉素音，張大偉，魏 鑫，劉忠山

(1.新疆農業科學院經濟作物研究所，烏魯木齊 830091，2.新疆海南良種繁育基地，烏魯木齊 830006)

0 引 言

【研究意義】離體胚培養是將分離的胚在人工培養的條件下，直接誘導發育成苗。該項技術廣泛應用于遠緣雜交獲得稀有雜種，單倍體的誘導，種子活力快速測定，特殊植物快速繁育等方面[1-5]。離體胚培養可以有效縮短作物育種時間，在棉花育種中有重要的應用潛力。離體胚培養省去種子成熟，休眠和萌發所需要的時間，可以加快作物世代繁殖，縮短作物育種時間，對品種培育具有重要意義。【前人研究進展】在培養基和胚齡對離體胚的成苗率研究方面，Borole等[6]利用添加不同濃度的生長素、細胞分裂素和赤霉素的BT培養基和MS培養基對(亞洲棉×陸地棉)F1雜交胚，胚齡為12、15、20、25DPA(days after pollination)的幼胚進行離體培養，發現20DPA成苗效果最好，BT培養基成苗要優于MS培養基，MS培養基中添加1.5 mg/L IAA，0.5 mg/L KIN和250 mg/L CH的處理只一株成苗，其它MS培養基處理組合均未成苗。葉春燕等[7]比較了不同的培養基、激素和胚齡等對棉花胚珠表皮纖維發育的影響，認為BT培養基較適合陸地棉胚珠的離體培養。徐莉等[8]篩選出適宜牡丹“鳳丹”的培養基，“鳳丹”的成苗率63.88%，成活率66.34%。徐陽等[9]研究了不同因素對甜柿幼胚的影響，影響大小依次為培養基、胚鈴、柿品種、培養條件。幼胚胚齡增大，胚成苗率逐漸提高。離體胚成苗培養不僅受到培養基和胚齡的影響，也受到溫度、光照的影響[10]。關麗霞等[11]研究了不同因素對后熟矮紫杉種子體胚萌發的影響，在白天溫度23℃(10 h)、夜間溫度13℃(14 h)的培養條件下，矮紫杉體胚萌發率可達94.44%。李麗等[12]研究了不同溫度、光照時間和激素組合對伊貝母種胚誘導及植株再生的影響，發現溫度為20℃，光照時間(12 h)為伊貝母種胚誘導最適宜條件，誘導率可達72.2%。【本研究切入點】目前，國內外對不同植物離體胚培養方面開展了大量的研究，該技術在加快世代繁殖，縮短育種時間等方面具有廣泛應用價值[13]，但在早熟陸地棉方面研究相對較少。以往研究主要是基于無菌培養環境和成分復雜的培養基條件下開展的，由于培養基成分復雜、配制繁瑣且對試驗環境要求較高，限制了該技術在生產中的大規模的應用。在有菌水培條件下，建立一種操作簡便、適宜大規模應用的棉花離體胚成苗技術。研究培養基、胚齡、溫度和光照時間對棉花胚成苗的影響。【擬解決的關鍵問題】選用早熟棉新品系作為研究材料，研究不同因素對離體胚的成苗率、成苗時間、根系性狀的影響及有菌、無菌培養污染發生特點。在菌水培條件下，分析早熟陸地棉離體胚成苗培養最適宜的胚齡、溫度和光照時間條件，為大規模開展以離體胚成苗技術為核心的棉花1年多代研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

以早熟陸地棉新品系M319為試驗材料，生育期120 d。2018～2019年，試驗材料在瑪納斯縣六戶地鎮試驗田內種植。棉花離體胚培養分別在新疆農業科學院瑪納斯育種基地和新疆農業科學院經濟作物研究所實驗室內完成。

1.2 方 法

1.2.1 取 樣

棉花第2、3果枝開花當日進行掛牌并登記開花日期，當胚齡達到15、20、25、30和35 d分別摘取棉鈴進行離體胚的培養。

1.2.2 接 種1.2.2.1 MS培養接種(無菌培養)

棉鈴先用自來水清洗表面，然后用吸水紙去除表面水分。在超凈工作臺內，用75%乙醇浸泡30 s，2次，用無菌水沖洗5～7次，15%H2O2消毒5 min，用無菌水沖洗3～4次，用無菌濾紙吸取表面水分，用滅菌解剖刀和鑷子將胚取出，接種MS培養基上每瓶接種10粒，每個處理6瓶。

1.2.2.2 蒸餾水、普通水(自來水)培養接種(有菌培養)

操作為有菌操作，使用發芽盒、解剖刀等均不需要滅菌。棉鈴表面先用清水洗去表面灰塵，然后用吸水紙去除表面水分，用刀片將棉鈴切開，取出棉花胚用于培養。

離體胚培養的懸浮支撐物：選取5 mm左右厚度泡沫板，長寬可以根據發芽盒的大小確定；用打孔器在泡沫板上打孔，孔徑直徑大小根據胚的具體大小確定，以棉花胚根萌發部位接觸水的表面，以不落入水為準，每個泡沫板打20個孔。

將自來水、蒸餾水倒入約發芽盒體積2/3位置即可，放入懸浮物，將棉花離體胚放入懸浮泡沫板孔洞內，用透明保鮮膜進行密封處理，然后放入光照培養箱進行培養。

1.2.3 試驗設計1.2.3.1 不同培養基和胚齡條件下的離體胚成苗培養

采用雙因素設計。其中培養基為3種：MS、普通水(自來水)、蒸餾水，其中MS為對照(CK)；胚齡胚為5水平：15、20、25、30和35 d，共計15個處理。MS培養每個處理設6個重復，蒸餾水和普通水培每個處理設4個重復。

光照培養箱培養條件：溫度為28℃，光照時間為22 h，光照強度為12 000 lx。MS為無菌培養，蒸餾水和普通水為有菌培養。

1.2.3.2 光照時間、溫度的離體胚培養

研究溫度、光照時間對胚成苗的影響，試驗采用雙因素3水平設計，其中溫度為28、30和32℃，光照時間為12、22和24 h，共計9個處理，每個處理4個重復。按照最佳胚齡的胚為試驗對象，普通水為培養基，光照強度12 000 lx培養條件，將裝有離體胚的發芽盒放入光照培養箱內進行培養。表1

表1 不同溫度、光照時間處理

1.2.4 測定指標

成苗：離體胚的子葉90%面積變綠色即為成苗。

成苗時間：將裝有離體胚三角瓶和發芽盒放入培養箱內開始到成苗的時間。

根系長度：從白色下胚軸開始測量根的長度。

根數：計量長度大于0.5 cm根的數量。

成苗污染率=污染株數/總株數。

1.3 數據處理

采用Excel2007、Spss19.0統計軟件進行數據整理和分析。

2 結果與分析

2.1 離體胚的成苗污染

研究表明，有菌與無菌培養的菌類發生和生長的規律不同。普通水、蒸餾水培養屬于有菌培養，在培養過程中離體胚死亡后菌類在其表面迅速大量繁殖，部分有損傷的成苗在其損失部位出現菌類大量繁殖的現象，并且水中出現少量的藻類，但是對成苗影響較小。水培條件下，20、25、30和35 d胚的平均成苗污染率分別為15.8%、5.0%、2.8%和0.6%。在離體胚的成苗期內，污染胚或成苗表面菌類大量繁殖，不會影響其它正常胚或成苗的生長和發育。CK培養屬于無菌培養，培養瓶內污染速度快，4～5 d培養基和胚上全部長菌，嚴重影響胚的生長發育，最終導致胚或苗的死亡。

2.2 不同培養基條件下，胚成苗生長

研究表明，普通水、蒸餾水與CK培養條件下，相同胚齡的離體胚成苗后生長情況基本相同，不同胚齡之間生長差異較大。不同胚齡成苗具有以下特點：胚齡較小的胚成苗長勢弱，下胚軸和根纖細，根數較少，子葉小而薄，葉色淺綠。胚齡較大的成苗健壯長勢強，下胚軸和根系粗壯，子葉肥大顏色深綠。其中35 d胚成苗長勢最強，葉色深綠，胚軸和根粗壯，根數量多。圖1

圖1 普通水培養成苗(從左到右依次為20 d、25 d、30 d、35 d胚)

2.3 不同培養基、胚齡對胚成苗率和成苗時間的影響

研究表明，不同培養基條件下，離體胚的成苗率之間差異達到顯著水平，其中普通水與蒸餾水成苗率之間差異不顯著，與CK成苗率達到顯著水平，大小依次為CK>普通水>蒸餾水。雖然水培與CK成苗率相比存在極顯著性差異，但是隨著胚齡的增加相同胚齡的離體胚的成苗率差異逐漸減小，當胚齡為35 d時，3種培養基成苗率之間差異不顯著。在普通水培養條件下，20、25、30和35 d離體胚成苗率分別比對照低50%、36.3%、8.7%和1.3%；蒸餾水條件下，20、25、30和35 d離體胚成苗率分別比對照低51.3%、38.8%、10.0%和1.3%，其中15 d胚成苗率為0。當胚齡大于30 d時，水培與CK的胚成苗率相差10%以下，且成苗率均在90%以上。水培可以用于胚齡大于30 d胚的成苗培養。

不同胚齡離體胚成苗率、成苗時間之間差異達到極顯著水平(P<0.01)。水培條件下，35 d離體胚的成苗率最高達到98.8%，與其它胚齡成苗率的差異均達到顯著水平，大小依次為35 d>30 d>25 d>20 d>15 d。不同胚齡的離體胚成苗率呈現隨著胚齡的增加而增加的趨勢。不同胚齡胚的成苗時間之間差異達到顯著水平，成苗時間隨著胚齡增加而減少，成苗時間大小依次為35 d<30 d<25 d<20 d，其中35 d成苗時間最短為11.1 d。水培養的離體胚的最佳胚齡為35 d。圖2

圖2 不同培養條件下胚的成苗率

2.4 不同培養基、胚齡對根長和根數的影響

研究表明，普通水與蒸餾水的成苗根長之間差異不顯著，與CK成苗根長差異顯著，其平均根長大小依次為CK>普通水>蒸餾水。不同胚齡胚的成苗根長之間差異達到顯著水平，并且成苗根的長度隨著胚齡增加而增加，其中胚齡35 d的成苗根最長。

胚齡是影響成苗根數的關鍵因素，影響達到極顯著水平(P<0.01)。成苗的根數隨著胚齡的增加而增加，并且不同胚齡之間的成苗根數差異達到極顯著水平，根數大小35 d>30 d>25 d>20 d。表1，圖1

2.5 溫度、光照時間對胚的成苗率和成苗時間的影響

研究表明，不同溫度條件下，胚的成苗時間差異達到顯著水平，其中30與28、32℃條件下的成苗時間差異達到顯著水平，28與32℃條件下的成苗時間差異不顯著，成苗時間大小依次為30℃<28℃<32℃。30與28、32℃相比成苗時間分別縮短了0.8 和1.1 d。適宜的溫度可以縮短胚的成苗時間。

不同光照時間條件下，成苗時間之間差異達到顯著水平，大小依次24 h<22 h<12 h。光照時間越長，其成苗時間越短，其中光照時間24與12 h相比成苗時間縮短1.8 d，與22 h相比縮短了0.8 d，延長光照時間有利于縮短胚的成苗時間。

在不同處理中，T6成苗時間最短為9 d，與T3、T5成苗時間之間差異不顯著，與T1、T2、T4、T7、T8和T9成苗時間之間差異達到顯著水平。不同各處理成苗時間大小依次為T6

表2 不同溫度和光照時間下35 d離體胚成苗時間變化

2.6 不同因素及處理對成苗胚根系性狀的影響

2.6.1 不同因素及處理對成苗根長的影響

研究表明，在培養溫度30℃條件下，成苗的根長最長，與32℃條件下的成苗根長差異顯著，與28℃條件下的成苗根長差異不顯著，根長大小依次30℃>28℃>32℃。30℃是最適宜根長發育的溫度。

在培養光照時間12 h條件下，成苗的根長最長，與22、24 h條件下的成苗根長之間差異顯著，22與24 h條件下的成苗根長之間差異不顯著，根長大小依次為12 h>22 h>24 h。光照12 h是最適宜根長發育的光照時間。

T4處理的成苗根長最長，與其它處理成苗根長之間差異達到顯著水平，大小依次為T4>T1>T5>T7>T2>T6>T3>T8>T9。T4培養條件較其它處理更有利于根的伸長，其培養溫度為30℃，光照時間為12 h。表3

2.6.2 不同因素及處理對成苗根數的影響

研究表明，適宜的溫度有利于增加成苗的根數，其中30℃條件下成苗的根數最多，與28、32℃根數差異達到顯著水平，大小依次30℃>28℃>32℃。30℃時較其它溫度更有利于根數增加。

不同光照時間的成苗根數差異達到顯著水平，光照時間12 h條件下的成苗的根數最多，與22、24 h條件下的成苗根數之間差異顯著，22與24 h條件下的根數之間差異不顯著，根長大小依次為12 h>22 h>24 h。光照12 h與其它相比是根數的最佳光照時間。

T4處理的成苗根數最多，與其它處理成苗根數之間差異達到顯著水平，大小依次為T4>T5>T1>T6>T7>T2>T3>T8>T9。T4培養條件與其它處理相比，更有利于根數的增加，其培養溫度為30℃，光照時間為12 h。表3

表3 不同溫度和光照時間下35 d胚的成苗根發育變化

3 討 論

培養基和胚齡是離體胚成苗培養中的關鍵影響因素，對成苗率和成苗根系發育影響顯著。時香玉等[14,15]對個棉花種間雜交胚珠進行培養，發現雜種胚珠適宜培養時期是授粉后4～6 d，2 d的胚珠培養易產生愈傷組織，成胚率低，8 d后幼胚敗育或脫落。不同培養基胚珠培養獲得的胚和成熟胚的頻率不同，適宜雜種胚珠培養的培養基為：BT基本培養基+NH4Cl 1 000 mg/L+IAA 1.5 mg/L+KT 0.2 mg/L+GA 0.06 mg/L。胚珠產生胚和胚的萌發頻率不僅與培養條件有關，與其雜交組合的親本的生理特性也有很大關系。耿興敏等[16]研究表明，杜鵑遠緣雜交離體成苗培養中，不同培養基培養的胚成苗率存在差異，其中WPM(woody plant medium)培養基成苗率高于MS培養基，并且胚齡對雜交胚的萌發率及成苗途徑均有顯著影響。不同雜交組合最適宜拯救時間不同，幼胚容易形成愈傷組織，相對成熟胚容易形成苗。余小玲等[17]研究發現，不同培養基早食李胚成苗率差異較大，花后88 d胚在WPM培養基的成苗率比MS培養基上高1倍左右；胚的成苗率隨著胚齡增加而升高，至果實成熟時成苗率可達26.0%。陳穎等[18]研究發現，不同銀杏品種成熟離體胚在不同的培養基上培養，其成苗率、根長、苗高出現差異，不同培養基對成熟離體胚培養差異大于品種之間差異。王玉柱等[19]利用不同培養基對駱駝黃杏品種的不同胚齡進行培養，發現不同培養基和胚齡胚的成苗率不同，其中6種培養基中Tukey培養基為佳，胚成苗率隨著胚齡增加而增加。

試驗中研究發現，培養基、胚齡是離體胚成苗的關鍵因素，不同培養基、胚齡的成苗率差異達到顯著水平(P<0.05)，不同胚齡的離體胚成苗時間存在顯著差異(P<0.05)。雖然水培與MS培養的低齡胚成苗率差異顯著，但是隨著胚齡增加成苗率差異也逐漸減小。當胚齡為35 d時，水培與MS的胚成苗率相差僅為1.2%。這種情況出現主要是MS培養基可以提供低齡胚成苗所需物質，而普通水和蒸餾水則不能提供造成的。高齡胚由于子葉已經積累較多營養物質不需要從外界吸收大量的營養物質即可發育成苗，所以水培與MS的胚成苗率相差較小。對于不同胚齡胚，胚成苗率隨著胚齡增加而逐漸增加，其成苗規律與前人研究結果一致。胚齡不僅對胚的成苗率產生影響，同時也對成苗時間、根長、根數產生影響。在不要求無菌苗情況下，水培法可以用于早熟陸地棉花胚齡為35 d胚的離體培養，其與MS培養相比是一種操作簡單、經濟高效離體培養方法。

徐顯[20]研究發現，8月12日取胚齡為18、20、23和25 d胚培養均能成苗。8月19日所取的胚中只有23和25 d胚能夠成苗。該階段胚發育的平均溫度，≥20積溫均小于8月12日。胚齡確定幼胚作為離體培養指標是不可靠。試驗中，培養的離體胚為棉花第2、3果枝的棉鈴，并且35 d離體胚的成苗2年試驗結果具有較好重復性，因此，早熟棉第2、3果枝棉鈴的胚齡可以作為離體培養的參考指標。

溫度、光照時間是胚成苗及生長關鍵條件之一。張肖等[21]認為光照雖然影響胚根的生長，抑制胚軸的伸長，但有利于子葉長度的增加和葉綠素的合成。低溫和高溫不利于胚根的伸長和子葉生長；黑暗條件下溫度顯著影響胚軸生長。楊菲等[22]研究發現在同樣培養條件下，光照下紅豆杉離體胚的萌發率略高于黑暗下的萌發率，光照更利于幼苗生長。

溫度、光照時間是離體胚成苗時間的關鍵因素，不同的溫度、光照時間離體胚成苗時間之間存在顯著性差異(P<0.05)。適宜溫度可以縮短離體胚成苗時間，有利于根長的生長和根數的增加。光照時間的延長有利于縮短胚成苗時間，但是不利于根系的伸長和根數的增加。

4 結 論

培養基、胚齡、溫度、光照時間是影響離體胚成苗的關鍵因素。水培與MS培養條件下，胚齡35 d胚成苗率差異不顯著；高胚齡、適宜溫度和光照時間有利于離體胚的成苗和促進根系發育。在胚齡35 d、溫度30℃、光照時間24 h的培養條件下，離體胚的水培成苗效果好，可作為早熟陸地棉離體胚成苗簡化培養的適宜條件。