CD4+CD25+調節性T細胞在AIHA患者外周血中的表達及臨床意義

肖 捷 楊麗萍 肖 健 黃繼賢▲

1. 汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院體檢中心，廣東韶關 512025；2. 汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院血液內科，廣東韶關 512025；3. 汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院藥學部，廣東韶關 512025

自身免疫性溶血性貧血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）是一種人體B 淋巴細胞免疫調節紊亂，產生針對紅細胞進行破壞的自身抗體，繼而導致紅細胞壽命縮短和破壞加速為特征的獲得性免疫障礙貧血[1]。AIHA 的發病率約為3/10 萬，是一種少見病，近95% 成人和75% 的兒童患者為溫抗體型AIHA[2]。AIHA 好發于中老年，女性較男性常見。體液免疫在AIHA 發病機制中的作用已被認識多年。近年來，細胞免疫在AIHA 發病機制中的重要作用逐漸引起重視。調節性T 細胞誘導和維持外周免疫耐受，對預防過度的免疫反應和自身免疫中起至關重要的作用[3]。我們的前期研究[4]通過流式細胞儀檢測AIHA 初治患者和正常人的外周血CD4+CD25+調節性 T 細胞（CD4+CD25+regulatory T cell，Tregs）后發現，初治患者的Tregs 較正常人下降，提示Tregs 與AIHA 的細胞免疫異常機制有關。因此，我們延長了研究時間，檢測了完全緩解和復發AIHA 患者外周血Tregs 的變化情況，以期進一步確定Tregs 與AIHA 細胞免疫紊亂的可能關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009 年1 月～2019 年11 月就診于汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院的AIHA 患者，均為溫抗體型AIHA。健康對照組來自同期我院體檢中心的正常人。

1.2 方法

1.2.1 診斷標準 納入的患者均至少完成血細胞分析、網織紅細胞計數、膽紅素、直接和間接抗人球蛋白試驗、骨髓象、肝、膽、脾、胰B 超等檢查，AIHA的診斷標準以及療效判定標準均符合《血液病診斷及療效標準（第三版）》[5]。AIHA 復發的定義為AIHA 發病治療后達到完全緩解，其后疾病再次發作并達到診斷標準。

1.2.2 納入及排除標準 納入標準：符合《血液病診斷及療效標準（第三版）》[5]的AIHA 診斷標準。排除標準：（1）合并有嚴重心、肝、腎臟等重要器官功能不全者；（2）預期生存期短于半年者；（3）不能或拒絕配合隨訪的患者。

1.2.3 Tregs 檢測 AIHA 患者分別于初治時、治療后達完全緩解時、復發時采集外周血標本，以 CD45、CD4 和 CD25 抗 體（均 是 BECKMAN COULTER 公司產品）熒光標記活細胞及避光孵育，經溶血素處理后再次避光孵育，磷酸鹽緩沖液洗滌后重新懸浮細胞，通過流式細胞儀（BD 公司的FACSCalibur 型）檢測 CD4+T 細胞和 Tregs，具體方法參考我們的前期研究[4]。

1.3 統計學處理

本研究使用SPSS 20.0 軟件進行，計量資料以（x± s）表示，各組間的比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統計學意義。柱狀圖使用GraphPad Prism 7.0 軟件繪制。

2 結果

2.1 一般資料

共收集到符合條件的AIHA 患者28 例，其中男 8 例，女 20 例，中位發病年齡 47 歲（14 ～ 77）歲。患者起病時的血紅蛋白中位數為54（23 ～102）g/L，總膽紅素中位數為42.20（7.40 ～165.64）μmol/L，間接膽紅素中位數為33.65（6.60 ～123.50）μmol/L，直接膽紅素中位數為10.65（0.80 ～53.23）μmol/L。健康對照組為同期的健康體檢者，均無自身免疫性疾病及腫瘤病史，且年齡和性別與AIHA 患者相匹配，男 8 例，女 20 例，中位發病年齡 47（14 ～ 77）歲。

2.2 CD4+T細胞的分析

初治組和復發組AIHA 的CD4+T 細胞比例均較健康對照組低，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表1，圖1A。而初治組AIHA 和復發組AIHA 的CD4+T 細胞比例雖均較完全緩解組低，差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。

另外，初治組AIHA 的CD4+T 細胞比例和復發組比較差異無統計學意義（P ＞0.05）；完全緩解組AIHA 的CD4+T 細胞比例和健康對照組比較差異無統計學意義（P ＞0.05）

2.3 Tregs的分析

初治組和復發組AIHA 的Tregs 比例較健康對照組和完全緩解組均低，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。見表 1，圖 1B。

另外，初治組AIHA 的Tregs 比例和復發組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；完全緩解組AIHA 的Tregs 比例和健康對照組比較，差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。

表1 各組外周血CD4+T細胞和CD4+CD25+調節性T細胞的比較（x ± s，%）

圖1 （A）AIHA 初治組、復發組、完全緩解組和健康對照組外周血CD4+T 細胞的比較；（B）AIHA 初治組、復發組、完全緩解組和健康對照組外周血Tregs 的比較

3 討論

調節性T 細胞是T 細胞的一個亞群，具有調節免疫、免疫抑制和維持自身耐受的功能，能夠通過產生白介素-10、轉化生長因子等細胞因子抑制機體T 細胞的活化、增殖和發揮效應。調節性T 細胞按起源分為天然型調節性T 細胞（naturual regulatory T cell，nTreg）和誘導型調節性 T 細胞（induced regulatory T cell，iTreg）。CD4+CD25+既是nTreg 免疫表型，也是iTreg 的免疫表型，且nTreg和iTreg 具有類似的免疫抑制功能[6]，但兩者的作用有所差別。nTreg 在胸腺中分化、發育和成熟，在增強對自身抗原的耐受性方面起關鍵作用；而在外周免疫器官中誘導發育成熟的iTreg，分布于外周淋巴組織，與nTreg 不同，偏向于識別非自身抗原[7]。調節性T 細胞被認為通過各種可溶性細胞因子（包括IL-10，IL-35 和TGF-β）以及細胞表面分子（如CD25 和CTLA-4）（快速循環至/ 從細胞中回收）維持外周對自身抗原的耐受性方面至關重要[8]。

調節性T 細胞的細胞比例異常與1 型糖尿病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡（SLE）、多發性硬化、重癥肌無力等自身免疫病的發病機制可能有關。Ghonaim 等[9]對64 例1 型糖尿病患兒進行流式細胞術檢測外周血Tregs 后發現，1 型糖尿病患兒Tregs 減少，可能與1 型糖尿病的發病機制有關。Zhang 等[10]對37 例活動期和18 例慢性期的類風濕性關節炎患者及20 例正常人進行Tregs 等指標檢測后發現，類風濕性關節炎患者的Tregs 比例顯著低于健康對照組，而活動期組和慢性期組間則無明顯差異。Morita 等[11]對類風濕性關節炎與Treg相關的31 項研究進行Meta 分析后發現，Tregs 在類風濕性關節炎患者外周血的表達降低，而在滑液的表達卻升高。Li W 等[12]對總共納入628 例活動期SLE 患者和601 例正常人的18 項研究進行Meta 分析后發現，活動期的SLE 患者的調節性T 細胞抑制能力未見異常，但活動期調節性T 細胞百分比較緩解時明顯下降，因而考慮，調節性T 細胞的減少可能在活動期SLE 的發病機理中起作用。Danikowski的研究表明[8]，雖然目前尚未完全闡明自我耐受能力受損在多發性硬化和重癥肌無力的潛在機制，但調節性T 細胞的數量、功能和（或）遷徙缺陷是可能的細胞免疫致病機制之一。

調節性T 細胞與AIHA 患者的細胞免疫紊亂可能有關。Mqadmi A 等[13]給對照組小鼠反復輸入少量異體紅細胞后AIHA 的發生率為30%；而發病組以CD25 單抗清除小鼠體內的Tregs 后再反復輸入少量異體紅細胞，制成缺乏CD25 表達的AIHA模型，發現AIHA 的發生率上升至90%。此時如果輸注Tregs 給這些發病的小鼠，可減少紅細胞的自身抗體生成，繼而減輕溶血的發作；但不輸注Tregs而改為注輸注CD4+CD25-調節性T 細胞，卻不能減輕溶血發作。從而證明了Tregs 與小鼠的AIHA 的發病機制中的細胞免疫紊亂有關。我們的前期研究[4]通過流式細胞儀檢測外周血標本分析AIHA患者和正常人的Tregs，發現AIHA 初治者的Tregs較正常人下降。孫麗霞等[14]也通過流式細胞儀對AIHA 初治者、緩解的AIHA 患者和正常人的外周血標本進行Tregs 檢測，得出了與我們前期研究相同的結論（初治AIHA 患者的Tregs 較正常人下降），并發現緩解AIHA 患者Tregs 較發病時顯著上升。本研究再次驗證了我們前期研究及孫麗霞等[14]的結論，且進一步發現復發的AIHA 患者的外周血Tregs 也較正常人下降，與初治患者無統計學差異，從而進一步證明了外周血Tregs 與AIHA 的細胞免疫紊亂機制可能有關。

本研究還發現，AIHA 初治組和復發組CD4+T細胞比例均較健康對照組低。國內有學者發現特發性血小板減少性紫癜的患者，發病時檢測外周血CD4+T 細胞比例也減少[15]。本研究結果提示CD4+T細胞可能也與AIHA 的發病有關，其細胞比例的異常是否與Tregs 導致CD4+T 細胞的活化和增殖受限有關，值得進一步探討。

綜上所述，Tregs 在維持外周對自身抗原的耐受性方面至關重要，與自身免疫性疾病的發病機制有關。本研究發現，AIHA 初發病和復發患者的外周血Tregs 均較完全緩解和正常人下降，治療達完全緩解時明顯上升，與正常人無明顯差異，進一步提示Tregs 與AIHA 患者發病的細胞免疫紊亂機制可能有關。