霉變培養對果蠅眼色突變的影響*

歐陽雪艷 華樹海

（廣東省湛江市第二中學 廣東湛江 524022）

霉菌污染給人類的生產和生活帶來很多危害，食物霉變會導致外觀潰爛變形、產生腐敗氣味和黏液污穢物等，不僅降低食品的營養價值，而且還可能產生各種有毒有害物質，引起食用者急性中毒或慢性毒害。食物發霉后，二級胺、亞硝酸鹽等含量會提高，為亞硝胺的合成提供了物質條件。有研究表明，大鼠食用霉變食物后，在胃內合成了亞硝胺，且在胃內停留時間越長，合成的亞硝胺就越多。同時不排除有其他致癌物（例如霉菌毒素）的形成。霉變產生的毒素可能導致動物生長受阻、繁殖機能下降、組織壞死、免疫抑制、致癌及基因突變等［1］。本文通過研究霉變培養對果蠅眼色的影響，以探索霉變對動物生長發育的毒性。

1 實驗原理

1）通過每一代果蠅雌雄間交配，并重復多代以減少個體間的基因差異，得到同性別個體基因較一致的種系果蠅。

2）果蠅眼睛顏色的表現是由于大約80 多個基因在不同發育階段的表達和相互作用，這些基因的作用包括參與眼色素前體物的運輸、色素顆粒的合成、色素顆粒轉運和色素顆粒的沉積［2］。

3）霉變毒素影響果蠅眼色的表現過程。

2 實驗過程

2.1 實驗材料和用具

實驗材料：野生型黑腹果蠅。

實驗器具和藥品：數碼顯微鏡、保溫箱、電磁爐、高壓滅菌鍋、電子天平、培養瓶（錐形瓶）、量筒、白紙若干、紗布、小塑料條、藥棉、酵母粉、記號筆、膠圈、棉線、玉米粉、瓊脂、白糖、丙酸等。

2.2 實驗方法和步驟

2.2.1 培養基配方 玉米粉10 g、瓊脂粉1.5 g、酵母粉0.7 g、丙酸0.5 mL、水76 mL、白糖13.5 g。

2.2.2 培養基的配制

1）果蠅正常培養基的配制。在38 mL 水中加入瓊脂粉和白糖，煮沸使其充分溶解（期間不斷攪拌，防止糊底）。另取38 mL 水加入玉米粉攪勻，緩慢倒入上述瓊脂溶液中，繼續攪拌成糊狀煮沸。待培養基冷卻至70℃后加入0.5 mL 丙酸攪拌均勻，趁熱將培養基裝入培養瓶中約2 cm 厚，加蓋紗布棉塞后冷卻待用。培養瓶與紗布棉塞等應提前高壓滅菌［3］。接種果蠅前，再加入酵母粉和已消毒的小塑料條。

注意事項：①培養基分裝時需要注意的問題比較多，否則容易受到污染。最好在無菌室或超凈工作臺上分裝培養基，倒培養基時應注意不要沾到瓶口及瓶壁。②分裝好培養基的培養瓶及時蓋上紗布棉塞，冷卻放置1～2 d，待培養瓶上的水汽蒸發干。③不能過早將酵母粉加入培養基中，否則容易失活影響果蠅食用。

2）果蠅霉變培養基的配制。按上述配方配制培養基，不添加丙酸，不需要無菌操作。冷卻后用單層紗布封口，在室內分別放置6 d、12 d、24 d、30 d，使培養基發生不同程度的霉變。

2.2.3 對野生型果蠅的培養至第5 代 將野生型果蠅轉移至果蠅正常培養基中，斜放3 cm×10 cm的粗糙面的塑料條，在適宜溫度（約25℃）下進行培養。每星期更換一次培養基，對每一代的果蠅子代與親代進行分離，直至第5 代幼蟲。

2.2.4 霉變培養基中培養第6 代果蠅 將第5代果蠅幼蟲均分為2 個重復組，每個重復組隨機均分為4 組，分別轉移至不同發霉程度的培養基中進行培養，定期觀察果蠅生活狀態和生活力。待其交配并產生第6 代果蠅幼蟲后，將第5 代果蠅成蟲轉移出培養基，并繼續在各霉變培養基中培養第6 代果蠅至成蟲。

2.2.5 第6 代果蠅成蟲的麻醉 在麻醉瓶的棉塞上滴加少量乙醚，然后迅速拔去裝有果蠅培養瓶的棉塞。使培養瓶和麻醉瓶口相對，并拍打培養瓶使果蠅全都進入麻醉瓶，然后迅速將麻醉瓶塞上棉塞。麻醉后將果蠅倒在白磁板上。當果蠅翅膀上翹45°時，表示已死亡，不可再用［4］。

2.2.6 觀察果蠅第6 代的性狀 使用數碼顯微鏡，調至側面光源，將昏迷的果蠅置于載玻片上，不加蓋玻片，即可清晰觀察到果蠅各結構特征。甚至能觀察到昏迷果蠅的腹部運動，還可拍攝完整、清晰的圖片，便于結果的記錄、對比和分析。

3 實驗結果

3.1 果蠅主要性狀觀察 觀察經乙醚麻醉后果蠅的外部形態，包括口器、觸角、眼色、體色、翅形和剛毛等（圖1～圖3）。并從體形大小、腹背部條紋數、尾部圓銳和復雜程度、性梳的有無等特征鑒別果蠅的性別。性梳是一種梳狀的黑色鬃毛狀結構，位于雄果蠅前足第一附節前端的指狀突起處。雌果蠅無性梳，這是果蠅雌、雄鑒別的重要依據［5］。

圖1 果蠅前足剛毛

圖2 果蠅口器

圖3 果蠅腹部條紋

3.2 霉變培養對果蠅眼色的影響

3.2.1 圖片比較（圖4～圖6）

圖4 野生型和亮紅眼果蠅（圓圈標注）

圖5 紅眼（野生型）

圖6 亮紅眼（突變型）

3.2.2 數據記錄（表1、表2）

表1 不同程度發霉培養基中第6 代果蠅野生型和突變體的數量統計（重復組1）

表2 不同程度發霉培養基中第6 代果蠅野生型和突變體的數量統計（重復組2）

4 實驗結果分析

結果表明，霉變培養的2 個重復組中均有果蠅個體突變，且隨著霉變程度的增大，果蠅眼色變異率有增大趨勢。

5 實驗過程中所遇到的問題及解決方案

5.1 實驗溫度不適宜 果蠅培養的適宜溫度為23～25℃。培養溫度高于30℃時，會導致果蠅不育甚至死亡。培養溫度過低，果蠅生活周期會延長，生育力和生活力會下降。因此，可根據實際情況，將果蠅培養瓶置于適宜溫度的保溫箱中，定時觀察果蠅生活力及狀態。

5.2 培養基過濕或過干 實驗過程中會出現培養基過濕或過干的現象。過早地將酵母粉加入培養基，容易使培養基提前發酵，導致培養基濕度過大，粘住果蠅翅膀致其死亡，影響果蠅接種。培養基因失水而干結成塊，與瓶壁分離，不僅不利于果蠅產卵，且容易造成果蠅掉入縫隙致死。因此，培養過程中要視培養基情況及時轉接果蠅，酵母粉的選擇與添加時間也影響培養基的干濕，要謹慎挑選酵母粉并在轉移果蠅前加入培養基；為防止果蠅溺水可在培養瓶中斜放已消毒的3 cm×10 cm粗糙面塑料條（改變使用紙條的做法，紙條易吸水皺縮和發霉），為果蠅提供活動場所。

5.3 果蠅子代的轉移 果蠅產卵一段時間后，卵將進入幼蟲階段，幼蟲身體呈乳白色，較柔軟，此時需要對幼蟲進行轉移，以防培養基較長時間不更換而發霉，影響果蠅幼蟲的生長和發育。一旦果蠅幼蟲結繭便會粘附在培養瓶壁上，強行取下進行轉移會造成部分果蠅繭破裂而死亡，降低了果蠅子代的成活率。綜上，必須在果蠅幼蟲發育成繭之前對果蠅幼蟲進行培養基的轉移。由于果蠅幼蟲較柔軟，可使用棉簽刮下培養瓶壁上的果蠅幼蟲，注意動作要輕緩，以免對果蠅幼蟲造成傷害。

5.4 更換培養基時果蠅成蟲的轉移 更換培養基時果蠅成蟲的轉移較困難，既要防止果蠅飛出造成不同組混雜，又要避免對果蠅成蟲造成傷害，降低成活率。可使用已消毒的白紙，卷成漏斗狀，上部與原培養瓶口緊密相連，下部留出足夠果蠅進入的小孔并與新培養瓶口相連。既可保證進入培養基的果蠅是活動力較強的果蠅，又可防止其他污染物進入培養基。培養瓶下墊海綿，轉移過程中將培養瓶不停地敲打墊有海綿的桌面，使果蠅通過漏斗型的紙筒小孔掉入培養基中。

6 研究創新點

6.1 材料創新 為了研究霉變對動物生長發育的影響，本實驗使用生長周期短、繁殖速度快、相對性狀明顯的果蠅作為實驗材料。果蠅作為模式生物在初、高中實驗中卻較少被使用，本實驗為初、高中生物學教學中圍繞果蠅開展實驗提供了可行途徑。

6.2 方法創新

1）改變傳統使用體視鏡觀察果蠅的方法，采用數碼顯微鏡觀察，使用側面光源，清晰地觀察到放大倍數較高的果蠅結構特征，并可拍攝觀察與分析。

2）在轉移果蠅成蟲時，使用自制紙漏斗對其進行轉移。培養瓶下墊些海綿，轉移過程中將培養瓶不停地敲打墊有海綿的桌面，使果蠅通過紙漏斗的小孔掉入培養基中。

3）為防止果蠅溺亡可在培養基中斜放已消毒過的3 cm×10 cm 的粗糙面的小塑料條，為果蠅提供活動場所。

6.3 目的創新 經查證，已有的研究主要集中在酒精、甲醛等物質對果蠅生長發育和繁殖力各方面的影響，很多實驗在培養果蠅過程中避免培養基霉變，但少有實驗課題在霉變是否影響果蠅的生長發育方面做研究。本實驗從果蠅生長環境中最常見的霉變出發，通過將基因型基本相同的果蠅放置于不同發霉程度的培養基中，觀察霉變的培養基是否對果蠅眼色變異有影響，開創了新的實驗思路和方向。

果蠅眼色的控制因生化機制包括許多環節而存在多基因一效現象。研究表明，亮紅眼果蠅眼黃素含量極顯著低于野生型果蠅，而其果蠅喋呤含量無顯著差異。scarlet基因的產物負責果蠅眼黃素的跨膜運輸，研究者在scarlet基因中檢測到了7.5 kb的逆轉座子412 元件的插入，他們認為果蠅亮紅眼是scarlet基因突變導致轉錄提前終止，其編碼蛋白部分缺失或完全喪失功能,從而引起果蠅眼睛中眼黃素合成水平的降低，使得其呈現亮紅色［2］。逆轉座子在果蠅的生命周期中具有活性，同時還受到一系列環境和生理因子的調節，例如，幽醇類激素、脅迫、cAMP 水平、DNA 損傷因子等。霉菌毒素具有致畸、致癌、致變態等作用，對于DNA 穩定性有較大影響［6］。霉變培養中的霉菌毒素作為果蠅生活的脅迫條件，可能影響果蠅DNA 內部逆轉座子的活性，進而引起果蠅亮紅眼突變的發生。