BK多瘤病毒microRNA研究進展

周顯鳳，倪賢生

(傳染病預防控制國家重點實驗室研究基地，江西省動物源與媒介生物性傳染病重點實驗室，南昌市疾病預防控制中心微生物檢驗科，南昌 330038)

BK多瘤病毒(BK polyomavirus,BKV)是多瘤病毒家族成員之一，人群感染率高達90%，因能導致腎移植受者病毒性腎病而備受關注[1]。BKV原發感染時會出現“流感樣”癥狀，感染后通常潛伏于人泌尿系統上皮細胞中，腎臟移植后免疫抑制劑使用是導致BKV活化的重要因素，血液中持續的高病毒載量會引起腎移植組織損傷從而導致病毒性腎病(BKV-associated nephropathy,BKVAN)[2]。腎移植受者中約有近10%的患者發展為BKVAN，深入了解BKV的生物學特征及其與宿主的關系對預防疾病的發生和控制疾病進程至關重要。近幾年，有關BKV microRNA(miRNA)在病毒感染與宿主免疫的研究不斷增多，提示BKV miRNA在疾病診治、預防和控制中起關鍵作用。

1 BKV生物學特征及流行病學

BKV是1971年從腎小管狹窄的腎移植患者中分離到的第一個人多瘤病毒，病毒命名來源于患者名字的首字母“BK”[3]。BKV是乳頭狀多瘤空泡病毒科、多瘤病毒家族的一種亞型[4]。BKV是雙鏈環狀DNA病毒，其基因組大約5 kb，按功能分為3個區域：早期表達區域(大T、小T抗原)、非編碼控制區(non-coding control region,NCCR)以及晚期表達區域(病毒衣殼蛋白VP1-VP3編碼區)，晚期表達區域含有一個miRNA轉錄子，其與早期轉錄T抗原mRNA的3′端互補(封四圖1A)，被認為參與調控病毒早期基因表達和復制；成熟的3p和5p miRNA來源關于發卡結構的前體miRNA(pre-miRNA)(封四圖1B)[5-7]。

自BKV發現以來，至今一共有13種人多瘤病毒被發現并命名[4]。BKV原發感染多在10歲以前，傳播機制仍不清楚，可能經有呼吸道或者口腔傳播[8]。據血清流行病學調查顯示兒童在5歲以前的BKV血清陽性率高達50%，成人中的感染率高達90%以上[9]。對于免疫功能健全的人群，絕大部分終身都不會出現明顯的BKV感染癥狀或體征，但病毒可以一直潛伏在泌尿系統上皮細胞中。當機體免疫力低下，如HIV感染或器官移植后，潛伏在尿路上皮和腎小管上皮中的BKV被激活，開始高水平的病毒復制，大量復制的病毒顆粒從尿路中排泄，造成BKV尿癥(viruria)[10-12]。在腎移植受者中，隨著病程的進展，BKV會進入腎小管上皮細胞細胞核進行大量復制產生子代病毒，引起細胞壞死使組織發生免疫性、炎癥性侵潤；當腎小管上皮細胞脫落和基底膜暴露時，病毒開始破壞腎小管毛細血管進入血液，導致病毒血癥(viremia)，約有20%的腎移植受者會出現viremia。當BKV在血液中持續高病毒載量表達，將進一步破壞移植腎組織導致腎小管萎縮和間質纖維化，最終形成病毒性腎病(BKVAN)——BKV造成的最典型的疾病特征[13-15]。此外，出血性膀胱炎(HC)是造血干細胞移植(HSCT)受體中公認的BKV相關并發癥。越來越多的研究[16-17]證據表明，BKV編碼的miRNA參與調控病毒早期轉錄、病毒復制以及病毒免疫逃逸從而導致病毒活化和疾病惡化。

2 BKV編碼的miRNA

miRNA是一類單鏈、非編碼的RNA分子，長度一般為20～23個核苷酸。miRNA不編碼蛋白，而是通過與mRNA的3’端非編碼區的結合位點結合，降解或抑制mRNA的翻譯來抑制基因的表達，從而參與細胞發育、分化、凋亡等多種生物學過程。目前，編碼miRNA的病毒主要是皰疹病毒科的病毒如EB病毒、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒(KSHV)、人巨細胞病毒(MCV)和1型單純皰疹病毒(HSV-1)以及多瘤病毒科[18-21]。2005年SULLVIAN等[22]通過基因組掃描和前體miRNA預測得出與多瘤病毒SV40早期轉錄有關的段片段RNA為病毒編碼的miRNA，隨后miRNA相繼在包括BKV的其他多瘤病毒中報道[23]。目前已經確定的多瘤病毒編碼的miRNA及相關功能[5-7,24-25]總結如下，見表1。

表1 多瘤病毒miRNA及主要功能

2.1 BKV miRNA參與調控病毒復制

雖然多瘤病毒miRNA主要參與下調早期轉錄子翻譯等功能，但這些miRNA功能的具體機制尚不清楚。迄今為止，科研人員在不斷探索這些未知的機制機理。SULLIVAN 等[22]研究發現SV40編碼miRNA既能調節病毒早期基因表達，也參與宿主免疫逃逸。SEO等[23]通過實驗研究顯示BKV和JCV編碼miRNA抑制病毒早期基因表達從而影響病毒的復制水平。BROEKEMA等[26-27]還發現BKV編碼的miRNA與病毒潛伏機制有關，他們認為高水平表達的miRNA通過與早期T抗原mRNA 3’端互補控制病毒的復制。TIAN等[28]通過體外實驗發現BKV microRNA通過抑制T抗原介導的自調控降低病毒的復制水平。

BKV基因組根據NCCR區的基因結構可分為原型(Archetype)和重排型(Rearranged)，原型因在健康人群和病毒致病人群中均被發現而被認為是病毒的傳播型，重排型往往在病毒治病的人群中檢測到而被定性為致病型或者活化型。原型BKV NCCR結構可以分為O,P,Q,R,S共5個序列模塊(圖1A)，重排型則是這些序列模塊的部分重復或者缺失[29-30]。BROEKEMA等[5]通過體外實驗證明miRNA主要負責控制原型BKV的病毒復制，使其長期保持潛伏感染狀態(封四圖2)。BROEKEMA等[5]還推斷miRNA表達受NCCR區相關啟動子的影響，并認為除NCCR區啟動子以外可能在晚期DNA鏈中還隱藏著能啟動miRNA表達的啟動子。目前，未見其他有關病毒潛伏機制的報道，關于miRNA與病毒潛伏機制的關系仍然需要更多的實驗和臨床證據。

2.2 BKV miRNA參與病毒免疫逃逸

病毒miRNA除參與病毒復制調控意外，還與病毒逃逸宿主免疫有關。以往關于皰疹病毒的研究[31-32]表明，由3種不同的皰疹病毒(EBV、KSHV和HCMV)編碼的3種不同的病毒miRNA可以選擇性地靶向應激誘導配體MICB，而不是其他應激誘導配體，如ULBPs或MICA。MICB被NK細胞和其他免疫細胞表達的強大殺傷受體NKG2D所識別。因此，病毒miRNA對MICB的下調導致感染細胞從NKG2D介導的免疫識別和消除中逃逸[33-35]。由于人類多瘤病毒和皰疹病毒與人類宿主共存，它們均可以在免疫抑制條件下引起嚴重疾病。再者，因為BKV和JCV編碼miRNAs，所以研究人員推測BKV和JCV miRNA也可以靶向NKG2D配體，以逃避NKG2D介導的病毒清除。BAUMAN等[7]發現BKV 3p miRNA特異性下調應激反應誘導配體ULBP3的表達導致降低NKG2D受體依賴的NK細胞介導的細胞殺傷性；反之，病毒miRNA收到抑制會恢復配體ULBP3的表達，從而促進NK細胞毒作用。因此，開發miRNA靶向藥物用于精準治療病毒性腎病及相關多瘤病毒疾病具有廣闊的應用前景和臨床價值。

2.3 臨床樣本BKV miRNA檢測對疾病進展的診斷價值

當前沒有針對BKVAN的特效治療藥物，減少移植后免疫抑制劑的使用是控制病毒活化和疾病進程的主要手段[12]。既然miRNA參與調控病毒宿主免疫，且于病毒活化相關聯，那么定量檢測臨床樣本BKV miRNA含量是否有助于了解病毒活化狀態及疾病進程是值得探討的議題。HUANG等[36]對腎移植患者移植手術后不同時期的血液和尿液開展了BKV miRNA的定量檢測，同時還分析了血、尿BKV miRNA與病毒基因組和VP1 mRNA的定量關系。其結果提示BKV優選3p miRNA參與宿主細胞mRNA調控，并認為BKV miRNA介導NKG2D配體ULBP3下調的免疫逃逸影響遠大于其抑制病毒復制的作用，提示miRNA表達水平可與病程進展相關。因此，血、尿以及其他臨床標本病毒miRNA的定量檢測對輔助疾病診斷具有重要的價值[16,37]。無論如何，miRNA的檢測需要靈敏度高、特異性強的檢測方法，同時臨床樣本的保存條件也是影響miRNA檢測精度和真實度的重要因素。因此，對于腎移植受者來講，除了目前最新的臨床診療規范(2019版)推薦的尿液“誘餌細胞”(decoy cells)顯微鏡檢、血尿病毒載量監測以及活組織檢查外，同時開展病毒miRNA監測用于輔助診斷具有實質的臨床價值，同時利用接受者操作特性(ROC)曲線評估各指標的診斷靈敏度，為提出更合理且可操作的臨床和實驗診斷標準提供基礎。

3 小結

近年來，隨著實體器官移植手術的廣泛開展，新型強效免疫抑制劑的廣泛應用以及檢測手段的革新，BKV 致病率不斷升高。腎移植術后BKV 致病率升高尤為突出，由其導致的BKVAN已成為移植腎失功的重要原因之一。

BKVAN 的臨床表現缺乏特異性，容易與移植物排斥反應或其他疾病相混淆，尤其是急性排斥反應，后者治療需要增加免疫抑制強度以降低機體免疫導致的排斥反應，而BKVAN的預防治療恰恰相反，必須降低免疫抑制強度，以期部分恢復機體抗病毒免疫能力。所以，正確診斷并及時干預有助于改善移植受者的預后。血、尿BKV病毒載量監測是作為BKVAN風險評估的主要指標，當血BKV DNA載量>1.0×104copies·mL-1時，病變發展為BKVAN的風險極高，陽性預測值高達80%以上[12]。因為BKV miRNA表達發生在病毒復制前，且反映了病毒基因表達情況，可以作為病毒活躍復制的指征。其次，BKV miRNA序列非常保守，開發miRNA診斷方法可以有效覆蓋所有基因型BKV。

盡管BKV miRNA參與病毒轉錄復制及宿主免疫逃逸的相關研究關注度不斷提升，但目前的研究結論仍無法明確其調控機制。miRNA靶向序列眾多，BKV miRNA除靶向病毒本身早期T抗原mRNA和ULBP3外，是否還參與調控其他的細胞mRNAs是值得深入探索的方向?？傊钊胙芯緽KV microRNA參與宿主和病毒之間的相互作用將對病毒性腎病早期診斷、治療和預防提供新的思路。