錦燈籠中總酸漿苦素的含量測(cè)定及其質(zhì)量評(píng)價(jià)

廖 梅

(1.嘉應(yīng)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514031;2.廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 梅州 514031)

錦燈籠，又名酸漿、掛金燈、紅姑娘，為茄科酸漿屬植物酸漿Physalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino的干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼，其性寒，味苦，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、利濕除熱、清肺治咳、利濕化痰和利尿通淋之功效，常用于治療急性、慢性氣管炎、咽炎和小便不利等癥，是藥食同源的常用中藥，收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部[1-4]。錦燈籠的化學(xué)成分主要包括酸漿苦素類(lèi)、黃酮等多種成分[5-6]。其中該屬植物的專(zhuān)屬性特征成分酸漿苦素類(lèi)化合物為其主要活性成分，研究表明該類(lèi)成分具有顯著的抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗哮喘、防治糖尿病和利尿等活性[6-10]，具有很大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。目前對(duì)于錦燈籠的研究大多集中于對(duì)其酸漿苦素類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)和活性分析或者單個(gè)酸漿苦素類(lèi)成分的含量測(cè)定[11]，具有一定的局限性。酸漿苦素類(lèi)成分的活性顯著，現(xiàn)有文獻(xiàn)僅報(bào)導(dǎo)錦燈籠中酸漿苦素類(lèi)成分含量低微，但是其含量究竟有多少并無(wú)確切數(shù)據(jù)。因此，建立錦燈籠中酸漿苦素類(lèi)成分的含量測(cè)定方法將具有重要意義。鑒于酸漿苦素類(lèi)化合物的基本結(jié)構(gòu)為13，14-裂環(huán)-16，24-環(huán)麥角甾烷，其本質(zhì)上仍然屬于甾體類(lèi)化合物。文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果顯示總甾體類(lèi)的含量測(cè)定主要包括硫酸-甲醇法[12]、香草醛-高氯酸法[13]、香草醛-硫酸法[14]、Liebermann-Burchard[15]等方法。課題組前期對(duì)以上幾種方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示硫酸-甲醇法最佳，因此本實(shí)驗(yàn)擬采用硫酸-甲醇法作為錦燈籠中總酸漿苦素類(lèi)成分的含量方法。為了更好地評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地錦燈籠藥材質(zhì)量，彌補(bǔ)中國(guó)藥典對(duì)錦燈籠質(zhì)量控制的缺陷，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集24批來(lái)自不同產(chǎn)地的錦燈籠，采用硫酸-甲醇法建立錦燈籠中總酸漿苦素的含量測(cè)定方法，并利用該方法測(cè)定24批不同產(chǎn)地錦燈籠藥材飲片中總酸漿苦素的含量并評(píng)價(jià)其質(zhì)量?jī)?yōu)劣，為錦燈籠的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；MS103DU電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MING-CHE 24UV超純水機(jī)(法國(guó)Merck Millipore公司)。

1.2 試藥

β-谷甾醇對(duì)照品(純度>98%)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，分析純硫酸、冰醋酸和甲醇均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

24批錦燈籠藥材購(gòu)買(mǎi)自安國(guó)市藥材市場(chǎng)，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院張正偉副主任中藥師鑒定為茄科酸漿屬植物酸漿Physalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino的干燥宿萼(見(jiàn)表1)。

表1 錦燈籠樣品列表 Tab.1 List of selected samples of Physalis alkekengi

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取6 g錦燈籠藥材粉末于圓底燒瓶中，加入75 mL甲醇，稱(chēng)重，加熱回流提取30 min，放冷至室溫，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，過(guò)濾；濾渣重復(fù)上述步驟1次，合并2次提取液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液用甲醇稀釋5倍即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品貯備液的制備

精密稱(chēng)取10 mg β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加少量甲醇超聲使之完全溶解，繼續(xù)加甲醇定容至刻度線，配制成1 mg/mL的對(duì)照品貯備液，備用。供方法學(xué)考察和樣品測(cè)定用。

2.3 比色方法的確定

參考文獻(xiàn)[16]方法，精密吸取0.7 mL待測(cè)樣品溶液于比色管中，水浴揮干溶劑，精密加入硫酸-甲醇(9∶1)顯色劑1 mL，閉塞比色管并將其置于100℃下水浴反應(yīng)30 min后立即冰水浴30 min，再向比色管中加入5 mL冰醋酸，充分搖勻后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.4 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

吸取1 mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，配制成0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液；分別精密吸取0.2 mg/mL對(duì)照品溶液0.7 mL和供試品溶液0.7 mL于比色管中，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，充分搖勻后于200～1000 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描。結(jié)果見(jiàn)圖1，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和供試品溶液在386 nm有最大吸收，因此確定386 nm為本實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)。

注：a：對(duì)照品溶液；b：供試品溶液

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)備7支1 mL的容量瓶，分別吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL對(duì)照品貯備液于容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，制得0，0.1，0.2，0.4 mg/mL、0.6，0.8，1.0 mg/mL系列濃度的對(duì)照品溶液。分別吸取上述系列濃度的對(duì)照品溶液0.7 mL于比色管中，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2，得回歸方程為Y=1.27X+0.0698，R2= 0.9981，說(shuō)明對(duì)照品在0.1～1 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液各0.7 mL于比色管中，平行制備6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，6份溶液的吸光度值RSD值為1.96%，說(shuō)明該比色方法的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液0.7 mL和3號(hào)供試品溶液0.7 mL，平行制備3份，按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，反應(yīng)完成后于冰水浴中分別經(jīng)過(guò)5，15，30，45，60，90，120 min后，再向比色管中加入5 mL冰醋酸，充分搖勻后于測(cè)定386 nm處的吸光度。結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果表明對(duì)照品溶液和供試品溶液的吸光度值在冰水浴終止反應(yīng)后15～45 min內(nèi)波動(dòng)較小，測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選擇冰水浴終止反應(yīng)后30 min測(cè)定吸光度。

注：a：對(duì)照品溶液；b：供試品溶液

2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取3號(hào)錦燈籠藥材樣品6 g，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，平行制備6份。按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，6份溶液的吸光度值RSD值為1.71%，表明該顯色方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取已知含量的錦燈籠藥材粉末3 g，加入對(duì)照品溶液適量，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，平行制備3份。按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示平均加樣回收率分別為99.5%，RSD值分別為0.5%，表明該方法準(zhǔn)確可行。

2.5.6 含量測(cè)定

稱(chēng)取24批錦燈籠藥材粉末各10 g，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，平行制備3份。按照“2.3”項(xiàng)下方法操作，在386 nm下測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示不同產(chǎn)地錦燈籠中總酸漿苦素的含量差異較大，含量最高值達(dá)6.81±0.08 mg/g，含量最低的僅為3.31±0.04 mg/g，二者相差一倍以上；其中2、3、11、14、15和23號(hào)樣品均來(lái)自四川地區(qū)，總酸漿苦素含量分布于3.31-4.37 mg/g，整體偏低；產(chǎn)自東北的1、6、7、8、9、12、13、18、19、20、21和24號(hào)錦燈籠藥材，其總酸漿苦素含量也存在較大差異，分布于4.46～6.81mg/g之間，整體含量高于其它產(chǎn)地。這些結(jié)果表明，總體上錦燈籠中總酸漿苦素含量低微，僅占生藥量的3.31‰～6.81‰；無(wú)論是相同產(chǎn)地還是不同產(chǎn)地，不同來(lái)源的錦燈籠飲片質(zhì)量并不一致。

表2 含量測(cè)定結(jié)果(n = 3) Tab.2 The content determination results(n = 3)

表2(續(xù))

3 討論

酸漿苦素是錦燈籠藥材中的主要活性成分，屬于甾體類(lèi)成分，母體結(jié)構(gòu)中含有麥角甾烷，本身沒(méi)有特征紫外吸收，所以其總含量測(cè)定有一定難度。本實(shí)驗(yàn)利用甾體類(lèi)成分在無(wú)水條件下，能與強(qiáng)酸發(fā)生各種顯色反應(yīng)，采用硫酸-甲醇顯色法來(lái)測(cè)定錦燈籠藥材中的總酸漿苦素的含量，為錦燈籠藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

錦燈籠常用的提取方法為超聲提取和回流提取，本實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、料液比三個(gè)因素進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)總酸漿苦素的溶出影響最為明顯，最終選取甲醇為提取溶劑、料液比為1∶12.5、提取時(shí)間為30 min的回流提取法對(duì)錦燈籠重復(fù)提取2次的樣品前處理方案。

預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇與酸漿苦素類(lèi)成分經(jīng)顯色后的紫外吸收光譜一致，又因商品酸漿苦素類(lèi)對(duì)照品經(jīng)常缺貨，因此本實(shí)驗(yàn)采用價(jià)廉易得的β-谷甾醇作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)定錦燈籠中總酸漿苦素類(lèi)成分含量，方法學(xué)驗(yàn)證可行。

錦燈籠主要分布在我國(guó)東北、西北、四川等地，綜合本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地錦燈籠藥材中總酸漿苦素含量具有明顯差異，其中四川地區(qū)含量最低，東北地區(qū)含量相對(duì)較高；也發(fā)現(xiàn)即使是來(lái)自同一產(chǎn)地東北，不同批次的錦燈籠中總酸漿苦素含量也存在著較大差異，出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因可能是：一可能是采收方式、干燥方式、貯藏時(shí)間等不同，造成其有效成分含量存在著差異，通過(guò)觀察購(gòu)買(mǎi)回來(lái)的錦燈籠藥材，也發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)藥材的顏色最淺；二可能是由于市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的藥材來(lái)源眾多，好壞優(yōu)劣混雜其中，從而導(dǎo)致錦燈籠藥材質(zhì)量參差不齊。